Role of heat shock protein 70 and sulphatases 1 and 2 in apoptosis induced by cytotoxic cells of the immune system
Die Rolle von Hitzeschockprotein 70 und Sulphatasen 1 und 2 in Apoptose vermittelt durch zytotoxische Zellen des Immunsystems
by Sara Yasemin Demiroglu
Date of Examination:2009-04-23
Date of issue:2009-08-24
Advisor:Prof. Dr. Ralf Dressel
Referee:Prof. Dr. Detlef Doenecke
Referee:Prof. Dr. Dieter Heineke
Persistent Address:
http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD6B-B
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Intracellular heat shock protein 70 (HSP70) belongs to the stress response system and can protect cells from different apoptotic stimuli. Extracellular HSP70 on the other hand can activate cells of the innate and adaptive immune system. Acute overexpression of intracellular HSP70 could even increase the susceptibility of melanoma cells to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) that use the granule-exocytosis pathway for killing (Dressel et al. 1999). To decipher the molecular pathway of this increased susceptibility to CTLs, the effect of the acute overexpression of HSP70 on gene expression was analysed in cells, in which Hsp70 is under the control of a tetracycline-inducible promoter. The results indicated that the acute overexpression of HSP70 does not have a major impact on the regulation of other genes. Thus, the effects of HSP70 on CTL-mediated killing are most likely regulated on the protein level.To reduce the complexity of CTL-induced apoptosis, further experiments were performed with granzyme (Gr)B, a component of the cytotoxic granules of CTLs and NK cells, that has been shown to interact with HSP70. Acute overexpression of HSP70 significantly increased the percentage of melanoma cells with fragmented DNA and of melanoma cells with reduced mitochondrial cytochrome c content after GrB-induced apoptosis. These results suggest that HSP70 is not inhibiting GrB-induced apoptosis but can slightly enhance the progression of apoptosis in some cells. In staurosporine-induced apoptosis, in contrast, the acute overexpression of HSP70 partly protected the same cells from early apoptosis.Heparan sulphates (HSs) are involved in GrB-binding to target cells of CTLs and Raja et al. (2005) could show that a suppression of sulphation of HSs on the cell surface led to a reduced uptake of GrB and diminished GrB and CTL-induced apoptosis. A deficiency of the Sulf1 and Sulf2 genes, encoding for sulphatases 1 and 2, which modify the sulphation pattern of cells, could therefore have an effect on the efficiency of CTL-mediated apoptosis due to the fact that Sulf-deficient cells show increased sulphation patterns on HS proteoglycans (PGs).Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from Sulf1 and Sulf2 double knock-out mice were used as targets for CTLs. Their susceptibility to granule-exocytosis-dependent lysis was slightly but significantly increased. The slight change could be attributed to the deficiency of the Sulf1 gene. GrB-induced apoptosis was not significantly altered suggesting no major contribution of Sulf1 and Sulf2 genes to the control of susceptibility of target cells in GrB and CTL-induced apoptosis.However, during these experiments it turned out that the deficiency of Sulf1 and Sulf2 or both drastically increased the infection of these cells with adenovirus (AdV) type 5 that was used to deliver the GrB. Target cell infection was determined by green fluorescence protein (GFP) expression since the AdV contained a GFP expression construct. This increase was not explained by a different expression of receptors known to be involved in the uptake of AdV (coxsackie and adenovirus receptor (CAR) and integrin αv) on the Sulf-deficient MEFs. A digestion of HSPGs by heparinases II and III further increased the efficacy of infection. Similarly, a genetic defect of HSPGs in CHO cells was associated with an increased infection rate.These results suggest that HSPGs could function as decoy receptors for AdV channeling them into a non-infectious pathway rather than functioning as co-receptors for infection.
Keywords: heat shock protein 70; apoptosis; granzyme B; staurosporine; Sulf1; Sulf2; Adenovirus
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Intrazelluläres Hitzeschockprotein 70 (HSP70) gehört zum zellulären Stress-Antwort-System und kann Zellen vor unterschiedlichen apoptotischen Stimuli schützen. Extrazelluläres HSP70 hingegen kann Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems aktivieren. Die akute Überexpression von intrazellulärem HSP70 kann sogar die Suszeptibilität von Melanomzellen gegenüber zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), welche den zytotoxischen Granula-Exozytose-Weg benutzen, erhöhen (Dressel et al. 1999). Um die molekularen Mechanismen der erhöhten Suszeptibilität gegenüber CTLs zu entschlüsseln, wurde der Effekt der akuten Überexpression von HSP70 auf die Genexpression in Zellen, in denen Hsp70 unter der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promoters steht, analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die akute Überexpression von HSP70 keinen wesentlichen Einfluss auf die Regulierung anderer Gene hat, so dass die Effekte von HSP70 auf CTL vermittelte Zytotoxizität sehr wahrscheinlich auf der Proteinebene reguliert sind.Um die Komplexität der CTL vermittelten Apoptose zu reduzieren, wurden weitere Experimente mit Granzym (Gr)B durchgeführt, eine der Komponenten der zytotoxischen Granula von CTL und natürlichen Killerzellen (NK), für die auch eine direkte Interaktion mit HSP70 gezeigt werden konnte. Die akute Überexpression von HSP70 erhöhte den Anteil von Melanomzellen mit fragmentierter DNA und mit reduziertem mitochondrialem Cytochrom-C-Gehalt nach GrB-induzierter Apoptose signifikant. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HSP70 die GrB-induzierte Apoptose nicht inhibiert sondern stattdessen das Voranschreiten der Apoptose leicht beschleunigen kann. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse der Staurosporin-induzierten Apoptose, bei der die akute Überexpression von HSP70 dieselben Zellen vor früher Apoptose schützte.Heparansulphate (HS) sind in die Bindung von GrB an Zielzellen von CTLs involviert und Raja et al. (2005) konnten zeigen, dass eine Verminderung der Sulphatierung von HS auf der Zelloberfläche zu einer reduzierten Aufnahme von GrB und zu verminderter GrB- und CTL-vermittelter Apoptose führt. Die Defizienz der Sulf1- und Sulf2-Gene, die für die Sulphatasen 1 und 2 kodieren, welche das Sulphatierungsmuster von Zellen modifizieren, könnte einen Effekt auf die Effizienz der CTL-vermittelten Apoptose haben, weil Sulf-defiziente Zellen ein erhöhtes Sulphatierungsmuster von Proteoglykanen (PG) aufweisen.Embryonale Fibroblasten von Sulf1- und Sulf2-doppeltdefizienten Mäusen wurden als Zielzellen für CTLs benutzt. Ihre Suszeptibilität gegenüber Granula-Exozytose abhängiger Lyse war leicht aber signifikant erhöht. Die leichte Veränderung konnte der Defizienz des Sulf1-Gens zugeschrieben werden. Die GrB-induzierte Apoptose war nicht signifikant verändert, was darauf schließen lässt, dass die Sulf1- und Sulf2-Gene nicht wesentlich zur Kontrolle der Suszeptibilität von Zielzellen gegenüber GrB-und CTL-induzierter Apoptose beitragen.Allerdings zeigte sich während dieser Experimente, dass die Defizienz von Sulf1 und Sulf2 oder beiden Genen die Infektion dieser Zellen mit Adenovirus (AdV) Typ 5, der benutzt wurde, um GrB in die Zellen zu bringen, drastisch erhöhte. Die Zielzellinfektion wurde mittels des grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) ermittelt, da der AdV ein GFP-Expressionskonstrukt enthielt. Diese Erhöhung konnte nicht durch die unterschiedliche Expression von Rezeptoren, welche als Rezeptoren des AdV bekannt sind (Coxsackie und Adenovirus Rezeptor (CAR) und Integrin αv) auf Sulf-defizienten MEFs erklärt werden. Ein Verdau von HSPGs durch die Heparinasen II und III erhöhte die Effizienz der Infektion weiter. Gleichermaßen führte auch ein genetischer Defekt von HSPGs in CHO-Zellen zu einer erhöhten Infektionsrate.Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass HSPGs eher als Decoy -Rezeptoren fungieren könnten, um AdV in nichtinfektiöse Wege zu schleusen, statt als Ko-Rezeptoren für eine Infektion.
Schlagwörter: Hitzeschockprotein 70; Apoptose; Granzym B; Staurosporin; Sulf1; Sulf2; Adenovirus