Identifikation und funktionelle Charakterisierung von Effektorproteinen des Typ III Sekretionssystems von Chlamydophila pneumoniae

Abstract

Chlamydophila pneumoniae verursacht atypische Pneumonien und wird darüber hinaus mit einigen chronischen Erkrankungen wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung oder Arteriosklerose in Verbindung gebracht. Der gesamte Entwicklungszyklus der obligat intrazellulären Chlamydien findet in der Wirtszelle in einer Vakuole, dem Einschlusskörper, statt. Die Sekretion von Effektorproteinen durch das Typ III Sekretionssystem (TTSS) bietet den Chlamydien die Möglichkeit, über die Membran des Einschlusskörpers in Signalprozesse der Wirtszelle eingreifen zu können. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von putativen Effektorproteinen des TTSS hinsichtlich ihrer Transkription, Lokalisation und Funktion in der Wirtszelle. Die putativen Effektorproteine Cpn0708 und Cpn0712 wurden aufgrund ihrer Zugehörigkeit zu einem Subcluster des TTSS-Genkomplexes ausgewählt. Für Cpn0809 konnte eine Expression 48 h nach der Infektion (pI) und eine Lokalisation innerhalb der Wirtszelle gezeigt werden. Die Transkription von cpn0708 und cpn0712 konnte in Infektionsversuchen mittels RT-PCR-Analysen 8 h pI. nachgewiesen werden, wobei zum Ende des Entwicklungszyklus` eine Verminderung der Transkription zu erkennen war. Zur Analyse der Expression und Lokalisation wurden polyklonale Antiseren gegen die entsprechenden rekombinanten Proteine generiert. Immunfluoreszenztests von C. pneumoniae-infizierten Wirtszellen zeigten eine Lokalisation von Cpn0708 ausschließlich im Einschlusskörper, so dass ein Einfluss auf die Wirtszelle eher unwahrscheinlich ist. Cpn0712 dagegen konnte im Einschlusskörper, sowie im umliegenden Cytoplasma der Wirtszelle detektiert werden. Da Chlamydien sich genetisch nicht manipulieren lassen, sollte die Sekretion der bakteriellen Effektorproteine über ein heterologes TTSS in Salmonellen bestätigt werden. Da sie jedoch mit Ausnahme des Konstruktes, das aus cpn0713 und dem 5`Bereich von cpn0712 bestand, in Salmonellen nicht detektiert werden konnten, scheint dieses System nicht geeignet zu sein, um eine heterologe Typ III Sekretion von chlamydialen Proteinen zu überprüfen. Daher wurde hier mittels Transfektionsversuchen der entsprechenden Chlamydiengene in HeLa-Zellen die Funktion von Cpn0712 und Cpn0809 in der Wirtszelle untersucht. Cpn0809 konnte am ER lokalisiert werden, während Cpn0712 an Bestandteile des Cytoskeletts assoziiert zu sein scheint. Weder die Entwicklung des Einschlusskörpers noch der Verlauf nachfolgender Infektionen wurde durch die Expression von rekombinantem Cpn0712 bzw. Cpn0809 beeinflusst. Mittels Mikroarray wurde die durch Cpn0712 bzw. C. pneumoniae ausgelöste Veränderung der Genexpression in der Wirtszelle untersucht. Dies sollte einen ersten Einblick des Einflusses von Cpn0712 auf die Wirtszelle liefern. Es wurden 237 Wirtszellgene gefunden, deren Transkription sich durch Expression von Cpn0712 in der Wirtszelle um das Dreifache veränderte. Sechs Gene wurden identifiziert, die durch Cpn0712 und C. pneumoniae in gleicher Weise in ihrer Transkription verändert wurden, aber auch eine Vielzahl von Genen, die eine gegensätzlich veränderte Transkription aufwiesen. Das Beispiel krt17 zeigte, dass ein Wirtsgen abhängig vom aktiven oder persistierenden Zustand der Chlamydien zwischen einer verstärken und einer verminderten Transkription wechseln kann: In dieser Arbeit konnte eine vermehrte Transkription von krt17 nach C. pneumoniae-Infektion und eine verminderte Transkription nach Transfektion mit cpn0712 nachgewiesen werden, so dass die Unterschiede zwischen Cpn0712 und C. pneumoniae einen Hinweis auf eine Funktion von Cpn0712 im Persistenzstadium der Chlamydieninfektion darstellen könnte. Diese Arbeit hat gezeigt, dass Mikroarray-Analysen prinzipiell als neue Methode geeignet sind, die Bedeutung von bakteriellen Effektorproteinen von C. pneumoniae für die Wirtszellphysiologie zu untersuchen. Das anderseits aber noch Optimierung dieser Methode zukünftig nötig sind.