Structural and functional characterization of proteins involved in the biogenesis of spliceosomal U snRNPs

Abstract

Ein zentrales Merkmal eukaryotischer Zellen ist ihre Unterteilung in verschiedene von Membranen umschlossene Kompartimente. Die genetische Information eukaryotischer Organismen liegt in komprimierter Form in ihrem Zellkern, dem zentralen Kompartiment, vor. In eukaryotischen Zellen wird die Boten-RNA (engl.: messenger RNA) als Vorläufer-Boten-RNA transkribiert, deren kodierende Bereiche (Exons) durch nicht-kodierende Intronbereiche getrennt sind. Die Introns werden vor dem Transport der reifen Boten-RNA in das Zytoplasma durch einen großen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleißosom, entfernt. Das Spleißosom besteht hauptsächlich aus den so genannten uridin-reichen kleinen nukleären Ribonukleoproteinpartikeln (engl.: uridyl-rich small nuclear ribonucleoprotein particles, UsnRNPs). Die Biogenese der UsnRNPs schließt in höheren Eukaryoten einen nukleo-zytoplasmatischen Transportzyklus ein. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der strukturellen sowie funktionellen Charakterisierung zweier verschiedener Proteine und eines Proteinkomplexes, die im Zusammenhang mit der UsnRNP Biogenese stehen bzw. das RNA 5 -cap binden. Dabei handelte es sich um die Dimethyltransferase TGS1 (Trimethylguanosin Synthase 1), die die zweifache Methylierung des 5 -Guanosins spezieller RNA-caps katalysiert. Der zweite Schwerpunkt lag auf der Charakterisierung eines Exportkomplexes, welcher aus dem zu transportierenden Protein Snurportin 1, dessen Exportin (Exportin 1) und dem kleinen molekularen Schalter RanGTP besteht. Darüberhinaus sollte der Bindungsmodus der Poly(A)-spezifischen Ribonuklease an das 5 -mRNA-cap strukturell untersucht und beschrieben werden. Im Folgenden werden die Ergebnisse der einzelnen Projekte kurz zusammengefasst. Die Methyltransferase-Domäne der Trimethylguanosin Synthase 1 (TGS1), die das m7G-cap der spleißosomalen UsnRNAs während ihrer Reifung im Zytoplasma zweifach methyliert, wurde kristallisiert und ihre dreidimensionale Struktur wurde bestimmt. Die aktive Form dieser Domäne besteht aus dem strukturell konservierten Methyltransferase-Faltungsmotiv sowie einer kleinen N-terminalen, α-helikalen Domäne. Durch biochemische Analysen, sowie weitere kristallographische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die N-terminale Domäne für die korrekte Bindung beider Substrate, sowie für die katalytische Aktivität des Enzyms essentiell ist. Die funktionelle Analyse wurde durch einen neu entwickelten HPLC-gestützten Methyltransferase-Aktivitätstest ermöglicht. Desweiteren konnte durch die Kombination dieses Aktivitätstests mit Mutagenese-Studien ein Reaktionsmechanismus verifiziert werden, der auf Grundlage der Kristallstruktur postuliert worden war. Der Exportkomplex bestehend aus dem Exportin 1 (Xpo1, CRM1), seinem Kargo Snurportin 1 und dem molekularen Schalter Ran in seiner GTP gebundenen Form wurde in vitro assembliert und kristallisiert. Die Analyse der Kristallstruktur zeigt, dass das Exportin in seiner superhelikalen, torusartigen Gestalt die kleine GTPase Ran in ihrem Inneren einschließt. Dagegen bindet das zu transportierende Snurportin 1 über drei verschiedene Regionen auf der Außenseite des Exportins und steht nicht in direkter Verbindung mit RanGTP. Zwischen beiden Proteinen vermittelt eine saure Schleife des Exportins indirekte Kontakte. Durch diesen Bindungsmodus lässt sich das beobachtete außerordentlich breite Substratspektrum des Exportins 1 erklären. Außerdem ist auch die Kooperativität bei der Bildung des Exportkomplexes aus seinen drei Bestandteilen auf diese Anordnung der Komponenten zurückzuführen. Die RNA-Bindedomäne der Poly(A)-spezifischen Ribonuklease (PARN) wurde gereinigt und im Komplex mit dem cap-Analog m7GTP kristallisiert. Die Analyse der Kristallstruktur sowie weitere biochemische Charakterisierungen zeigten, dass das positiv geladene m7G-cap in einer bisher nicht beobachteten Form an das Protein gebunden ist. Dabei wird die Purin-Base des m7G-caps auf einer Seite von der Seitenkette eines Tryptophanrestes flankiert, während sich überraschenderweise auf der anderen Seite der Base keine Proteinseitenkette befindet. Die in der Kristallstruktur beobachtete Bindung konnte über Fluoreszenzspektroskopie für das Wildtypprotein sowie verschiedene Mutanten verifiziert werden. Dabei ermöglichte die Änderung der emittierten Fluoreszenz von Tryptophanen nach der Bindung des zugegebenen m7G-caps die Bestimmung von Dissoziationskonstanten.