Functional analysis of the Bazooka protein in the establishment of cell polarity in Drosophila melanogaster
Funtionelle Analyse des Bazooka-Proteins während der Etablierung der Zellpolarität in Drosophila melanogaster
by Michael Krahn
Date of Examination:2009-06-18
Date of issue:2009-10-14
Advisor:Prof. Dr. Andreas Wodarz
Referee:Prof. Dr. Andreas Wodarz
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
Persistent Address:
http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD76-2
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
Components of the PAR/aPKC (partitioning-defective / atypical protein kinase C) complex have been found to play a key role in the establishment and maintenance of cell polarity in various cell types. The underlying mechanisms are highly conserved throughout evolution, from worm to mammals. Research in the fruit fly Drosophila melanogaster revealed that Bazooka as the core component of the PAR/aPKC complex acts on top of a hierarchy in the regulation of cell polarity. Not only the establishment of epithelial cell polarity, but also the asymmetric cell division of the neural stem cell (neuroblast, NB) and the determination of the distinct cell fates of the two daughter cells are dependent on asymmetric localization of Bazooka. However, it is not yet fully elucidated how exactly Bazooka itself is localized to the apical membrane domain and how its targeting is regulated during the establishment and maintenance of cell polarity. In this study, a systematic structural analysis of the Bazooka protein was performed, using deletion constructs tagged with green fluorescent protein (GFP) in transgenic flies and in cell culture experiments in order to clarify the role of the distinct domains of the protein. We found that the C-terminal region of Bazooka, contains a new lipid binding motif and is crucial for membrane association of the protein. Furthermore, the role of two different phosphorylation events of Bazooka were elucidated: First, (de)phosphorylation at the conserved serine residue 1085 by the kinase PAR-1 and the phosphatase PP2A controls apical-basal polarity in dividing embryonic NBs by regulating a binding site for the adaptor proteins 14-3-3ε and Leonardo. Defects in this pathway lead to frequent reversal of apical-basal polarity in embryonic NBs. Second, the interaction of Bazooka with aPKC, which phosphorylates Bazooka at the conserved serine residue 980, was investigated in more detail. Overexpression of a non-phosphorylatable version of Baz leads to a drastic dominant negative phenotype with a total loss of cell polarity and embryonic lethality.
Keywords: Cell polarity; Bazooka; PAR-3; protein phosphorylation
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Für Komponenten des sogenannten PAR/aPKC- (partitioning-defective / atypische Proteinkinase C) Komplexes wurde nachgewiesen, dass sie eine Schlüsselrolle in der Entstehung und Erhaltung der Zellpolarität in unterschiedlichen Zelltypen spielen. Die grundlegenden Mechanismen scheinen hierbei in der Evolution zwischen Wurm und Mensch stark konserviert zu sein. Forschung an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat gezeigt, dass Bazooka als Kernkomponente des PAR/aPKC Komplexes an der Spitze einer komplexen Hierachie steht, die die Zellpolarität reguliert. Nicht nur für die Etablierung der Zellpolarität in epithelialen Zellen, sondern auch für die asymmetrische Zellteilung der neuralen Stammzellen (Neuroblasten) und für die Determinierung der Schicksale der beiden Tochterzellen ist die asymmetrische Lokaliserung von Bazooka essentiell. Trotzdem ist immer noch nicht geklärt, wie genau Bazooka selbst an die Membran lokalisiert wird und wie diese Rekrutierung während der Etablierung der Zellpolarität reguliert wird. In der vorliegenden Studie wurde eine systematische Strukturanalyse des Bazooka- Proteins vorgenommen, indem Fusionsproteine aus Bazooka-Deletionskonstrukten und dem grünen fluoreszierenden Protein (GFP) in transgenen Fliegen und in der Zellkultur exprimiert wurden. Dabei wurde festgestellt, dass die C-terminale Region von Bazooka ein neues Lipid-Bindemotiv enthält und essentiell für die Membranlokalisierung des Proteins ist. Des weiteren wurde die Rolle von zwei Phosphorylierungen näher untersucht: Zum einen die Phosphorylierung und Dephosphorylierung des konservierten Serinrestes 1085 durch die Kinase PAR-1 und die Phosphatase PP2A, wodurch die apikal-basale Polarität in Neuroblasten kontrolliert wird. Dies geschieht durch die Regulierung einer Bindestelle für die Adaptorproteine 14-3-3ε und Leonardo. Defekte in dieser Signalkaskade führen in einem hohen Anteil embryonaler Neuroblasten zu einer Umkehr der apikal-basalen Polarität. Zweitens wurde die Interaktion zwischen Bazooka und aPKC, welches Bazooka an dem konservierten Serinrest 980 phosphoryliert, genauer charakterisiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Überexpression einer nicht phosphorylierbaren Variante von Bazooka zu einem drastischen dominant-negativen Phänotyp führt, der mit einem Verlust der Zellpolarität und embryonaler Letalität verbunden ist.
Schlagwörter: Zellpolarität; Bazooka; PAR-3; Proteinphosphorylierung
