High-resolution characterization of structural changes involved in prion diseases and dialysis-related amyloidosis

Abstract

Proteinaggregation ist die Ursache vieler Krankheiten, wie Diabetes Mellitus Typ 2, Parkinsonsche, Alzheimersche und Huntingtonsche Krankheit, spongiforme Encephalopathien, Stauungsinsuffizienz und Dialyse-assoziierte Amyloidose. All diesen Störungen liegt eine Proteinfehlfaltung zugrunde, die zur Bildung von Fibrillen und Ablagerung amyloider Plaques an verschiedenen Stellen im Körper führt.Aufgrund des hohen Molekulargewichts von Fibrillen und der immanenten Heterogenität von Zwischenzuständen im Entstehungsprozess stellt die Untersuchung solcher Aggregate eine besondere Herausforderung für einen Strukturbiologen dar. Die Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance NMR) bietet jedoch eine einzigartige Möglichkeit, solche Aggregationsprozesse in beliebigen Stadien zu untersuchen vom Monomer bis hin zur fibrillären Form.Unter Verwendung verschiedener NMR-Techniken werden im Rahmen dieser Arbeit strukturelle Veränderungen untersucht, die an Prionenerkrankungen und Dialyse-assoziierter Amyloidose beteiligt sind.Die Ursache von Prionenerkrankungen liegt in der Aggregation des nativen α-helikalen Prionproteins PrPC in seine pathologische β-faltblattreiche Isoform PrPSc. Obwohl der Umwandlungsmechanismus nach wie vor unklar ist, sind bereits mehrere Modelle für PrPSc vorgeschlagen worden. Die meisten beruhen auf der Annahme, dass sich während der Aggregation des Prionproteins Helix 1 in ein β-Faltblatt umfaltet. Im 3. Kapitel der Arbeit wird unter Verwendung verschiedener Stop-Mutanten des humanen Prionproteins gezeigt, dass keine solche Umfaltung auftritt. Darüber hinaus wird gezeigt, dass obwohl Helix 1 die Aggregation des Proteins unterstützt, sie von Proteinase K verdaut wird und somit nicht als β-Faltblatt vorliegt. Untersuchungen der Lösungsmittelinteraktion von PrP-Fibrillen zeigen eine erhöhte Flexibilität der Helix 1 und des β-Faltblattes 2 und führen zur Identifizierung einer kleinen und starren fibrillären Kernstruktur, bestehend aus 4 β-Faltblättern. Wichtig hierbei ist, dass Aminosäuren tief im Inneren dieser Kernstruktur der humPrP Fibrillen gefunden werden, die für die Artenbarriere und den M/V Polymorphismus am Codon 129 verantwortlich sind. Außerdem wird gezeigt, dass die fibrillären Formen einiger Stop-Mutanten des humanen Prionproteins gemeinsame strukturelle Merkmale aufweisen. Schließlich wird aufgrund der vorhandenen Daten ein Model für PrPsc vorgeschlagen.Die zweite Proteinfehlfaltungs-Krankheit, die hier untersucht wird, ist die Dialyse-assoziierte Amyloidose. Die Krankheit wird bei Patienten beobachtet, die unter chronischer Niereninsuffizienz leiden und einer Langzeithämodialyse unterliegen, und wird verursacht durch die Aggregation des beta-2-Microglobulins (hβ2m) der leichteren Kette des Typ I Haupt-Histokompatibilitätskomplexes. Aufgrund des niedrigen Molekulargewichtes (11 kDa) und des gut untersuchten siebensträngigen β-sandwich Faltungsmotivs betrachtet man hβ2m als ein gutes Modell, um Amyloiderkrankungen zu untersuchen. Im 4. Kapitel der Arbeit werden strukturelle Unterschiede zwischen zwei säuredenatuierten Zwischenzuständen hβ2m aufgezeigt, und experimentelle Daten werden vorgestellt die darauf hindeuten, dass die Dynamik der Vorläuferensemble die Morphologie der resultierenden Fibrillen beeinflusst. Darüber hinaus konnten neue Informationen bezüglich der Lösungsmittelinteraktion der amyloiden Aggregate gewonnen werden und flexible Bereiche innerhalb der Fibrillen des hβ2m identifiziert werden.Unabhängig von den oben genannten Projekten wird eine Untersuchung der elektrostatischen Interaktionen von Molekülorientierungen intrinsisch ungefalteter Proteine im Anhang A in Form eines Nachdruckes gezeigt. In der NMR-Spektroskopie werden schwache Molekülorientierungen verwendet, um dipolare Kopplungen beobachten zu können, welche als sensibler Gradmesser für die Struktur und Dynamik eines Biomoleküls gelten. Es wird gezeigt, dass die Orientierung ungefalteter Proteine maßgeblich von elektrostatischen Wechselwirkungen abhängt, mit der Ionenstärke in der Lösung skaliert und mittels eines vereinfachten elektrostatischen Modells vorhergesagt werden kann.