Proteindesign zur Verbesserung des Nucleosidanaloga-Umsatzes in menschlichen Zellen: Desoxycytidin-Kinase und UMP/CMP-Kinase
Protein design to improve the nucleoside analog turnover in human cells: deoxycytidine kinase and UMP/CMP kinase
by Stephan Ort
Date of Examination:2005-06-30
Date of issue:2005-08-26
Advisor:Prof. Dr. Dieter Gallwitz
Referee:PD Dr. Stefan Irniger
Persistent Address:
http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD84-2
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The human nucleoside and nucleoside monophosphate kinases play an important role in the activation of many nucleoside analogs which are used in the treatment of viral and cancer therapies. In this work, enzymes were examined that can be limiting in the activation of pyrimidine-based nucleoside analogs in human cells. Therefore the human deoxycytidine kinase (dCK) and the UMP/CMP kinase were cloned, overexpressed and purified. The human cytidine and deoxycytidylate deaminase were produced recombinantly and were included in the analysis, as besides the phosphorylation of nucleoside analogs by kinases, the inactivation by deaminases plays an important role.The crystal structure of the human dCK and UMP/CMP kinase were solved in collaboration with the group of Dr. Arnon Lavie. For the dCK, it was possible to obtain structures in complex with dCyt and two important nucleoside analogs AraC and gemcitabine. With these structures important information could be deduced about the binding and phosphorylation of those substrates. The human UMP/CMP kinase could be crystallized in the substrate-free conformation. This allowed the reconstruction of the catalyze mechanism by comparison with the crystal structures of other species, which were available in other, substrate-bound, conformations. The analyses of the human deaminases CDA and dCMP-DA showed that both enzymes are capable to deaminate important nucleoside analogs. The comparison of the activities of both deaminases showed that the biggest contribution to the inactivation of the nucleoside analogs is caused by the human CDA.The main goal of this work was to study the nucleoside kinases kinetically and by structure to obtain information for the design of mutants with improved kinase activity for nucleoside analogs.On the basis of sequence comparisons, deletion mutants of the dCK were created in which regions that form a loop in the crystal structures were removed partially. With the dCK?2 mutant it was possible to create a shift of the specificity from purine to pyrimidine substrates with nearly no change in the activity for the dCyt phosphorylation. An improvement of the kinase activity was not successful with these mutants.On the basis of structure and sequence comparison with Dm-dNK, catalytic important amino acids could be identified which lead to the design of the dCK triple mutant. With this mutant it was possible to reach a notable increase in the enzyme activity of the human dCK. Strikingly is the increase of the phosphorylation efficiency of the enzyme for the natural substrate dCyt by the factor of 41. Also, for the important nucleoside analogs in this work, the enzymatic activity was improved. For the nucleoside analog AraC, gemcitabine and 5-Aza-dCyt the kcat values increased by factors between 3 and 14. In addition to this, a new enzymatic activity was discovered. The dCK triple mutant is in comparison to the wildtype enzyme capable to efficiently phosphorylate Thd. At the same time the enzymatic activity for the purine substrates dGuo and dAde was reduced. Altogether there was for the dCK triple mutant a shift in the substrate specificity to the pyrimidine substrates with an increase of the activity at the same time.To show the relevance of these activity increments with regard to the activation of nucleoside analogs, experiments with human cells were carried out. Two methods for protein transduction have been tested successfully. The Pep-1 mediated protein transduction seems to have advantages in comparison to the method with PTD fusion proteins. The introduced proteins influenced the AraC activation in the cells positively. The comparison of wildtype enzyme and triple mutant showed that with the mutant at lower AraC and protein concentration a more effective killing of the cells can be achieved. These results introduce the possibility to use the dCK triple mutant within the scope of protein therapeutic experiments to modulate the nucleoside analog turnover in cancer cells.
Keywords: Nucleoside kinase; deoxycytidine kinase; UMP/CMP kinase; cytidine deaminase; deoxycytidylate deaminase; nucleoside analogs; gemcitabine; AraC; crystal structure; protein design
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Die menschlichen Nucleosid- und Nucleosidmonophosphat-Kinasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung einer Vielzahl von Nucleosidanaloga, die in der Behandlung von Virus- und Krebserkrankungen eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die limitierend für die Aktivierung Pyrimidin-basierter Nucleosidanaloga in menschlichen Zellen sein können. Dazu wurden die menschliche Desoxycytidin-Kinase (dCK) und die UMP/CMP-Kinase kloniert, überexprimiert und aufgereinigt. Da neben der Phosphorylierung durch Kinasen auch die Inaktivierung der Nucleosidanaloga durch Desaminasen eine wichtige Rolle spielt, wurden die menschliche Cytidin- und die Desoxycytidylat-Desaminase ebenfalls rekombinant hergestellt und in die Untersuchungen einbezogen.In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Arnon Lavie wurde die Kristallstruktur der menschlichen dCK und der UMP/CMP-Kinase gelöst. Für die dCK konnten dabei Strukturen in Komplex mit dCyt und den zwei wichtigen Nucleosidanaloga AraC und Gemcitabin erhalten werden. Daraus ließen sich wichtige Informationen über die Bindung und Phosphorylierung dieser Substrate ableiten. Die UMP/CMP-Kinase konnte in der Substrat-freien Konformation kristallisiert werden. Dies erlaubte die Rekonstruktion des Katalysemechanismus durch Vergleich mit Kristallstrukturen anderer Spezies, die in anderen, Substrat-gebundenen Konformationen vorliegen. Die Untersuchungen der menschlichen Desaminasen CDA und dCMP-DA ergaben, daß beide Enzyme in der Lage sind, wichtige Nucleosidanaloga zu desaminieren. Der Vergleich der Aktivitäten beider Desaminasen zeigt, daß der größte Beitrag zur Inaktivierung der Nucleosidanaloga in den Zellen wahrscheinlich von der menschlichen CDA ausgeht.Hauptziel dieser Arbeit war es, diese Nucleosid-Kinasen kinetisch und an Hand der Proteinstruktur zu untersuchen, um Informationen für das Design von Mutanten mit verbesserter Kinaseaktivität für Nucleosidanaloga zu erhalten.Auf der Basis von Sequenzvergleichen wurden Deletionsmutanten der dCK erstellt, bei denen eine Region, die in der Kristallstruktur einen Loop bildet, teilweise entfernt wurde. Bei der dCK?2-Mutante konnte dadurch, bei fast unveränderter Aktivität für die dCyt-Phosphorylierung, eine Verschiebung der Spezifität von Purin- zu Pyrimidin-Substraten erreicht werden. Eine Verbesserung der Kinaseaktivität gelang mit diesen Mutanten allerdings nicht.Auf der Basis von Struktur- und Sequenzvergleichen mit der Dm-dNK konnten katalytisch wichtige Aminosäuren identifiziert werden, die zur Entwicklung der dCK-Dreifachmutante führten. Mit dieser Mutante konnte eine deutliche Steigerung der Enzymaktivität der menschlichen dCK erreicht werden. Erstaunlich ist die Steigerung der Phosphorylierungseffizienz des Enzyms um den Faktor 41 für das natürliche Substrat dCyt. Auch für die in dieser Arbeit wichtigen Nucleosidanaloga konnte die Enzymaktivität verbessert werden. Für die Nucleosidanaloga AraC, Gemcitabin und 5-Aza-dCyt stiegen die kcat-Werte um Faktoren zwischen 3 und 14. Darüber hinaus konnte eine neue Enzymaktivität festgestellt werden. Die Dreifachmutante ist, im Gegensatz zum Wildtyp-Enzym, in der Lage, auch Thd effizient zu phosphorylieren. Gleichzeitig verringerte sich die Enzymaktivität für die Purin-Substrate dGuo und dAde. Insgesamt findet bei der Dreifachmutante eine Verschiebung der Substratspezifität zu den Pyrimidin-Substraten bei gleichzeitiger Erhöhung der Aktivität statt.Um die Relevanz dieser Aktivitätssteigerungen im Hinblick auf die Aktivierung von Nucleosidanaloga zu zeigen, wurden Experimente an menschlichen Zellen durchgeführt. Dabei konnten erfolgreich zwei Methoden zur Proteintransduktion getestet werden. Die Pep-1-vermittelte Proteintransduktion scheint dabei Vorteile gegenüber der Methode mit PTD-Fusionsproteinen zu haben. Die eingebrachten Proteine haben die AraC-Aktivierung in den Zellen positiv beeinflußt. Der Vergleich des Wildtyp-Enzyms und der Dreifachmutante zeigt, daß bei der Mutante bei niedrigerer AraC- und Proteinkonzentration ein effektiveres Abtöten der Zellen erreicht werden kann. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, die dCK-Dreifachmutante im Rahmen von proteintherapeutischen Versuchen zur Modulation des Nucleosidanalogon-Umsatzes in Krebszellen einzusetzen.
Schlagwörter: Nucleosidkinasen; Deoxycytidin-Kinase; UMP/CMP-Kinase; Cytidin-Deaminase; Deoxycytidylat-Kinase; Nucleosidanaloga; Gemcitabin; AraC; Kristallstruktur; Proteindesign