Neue Einblicke in die SNARE-vermittelte Fusion: Detektion einzelner Proteoliposomen mit einem konfokalen Mikroskop

Abstract

Unter der Vielzahl von intrazellulären Membranfusionen, die in einer eukaryotischen Zelle ablaufen, zieht die neuronale Exozytose das ganz besondere Interesse der Wissen-schaft auf sich. Das Wissen darüber, wie das Neurotransmitter-geladene Vesikel mit der präsynaptischen Membran fusioniert und seinen Inhalt in den synaptischen Spalt entleert, ist entscheidend für die Aufklärung von Erkrankungen des Nervensystems und für das Verständnis von Lernprozessen.Allen intrazellulären Membranfusionen ist gemein, dass sie durch die konservierte Proteinfamilie der SNAREs angetrieben werden. Diese Proteinen haben eine etwa 60 Aminosäuren lange, in Heptad-Wiederholungen angeordnete Sequenz, das SNARE-Motiv. Jeweils vier verschiedene SNARE-Motive sind auf die fusionierenden Membra-nen verteilt. Bei der Fusion lagern sie sich vom N-terminalen Ende des Motivs aus zusammen und bilden einen coiled coil-Komplex, wobei die beiden Membranen anei-nander gezogen werden und schließlich fusionieren. Die vor der Fusion liegenden Schritte, insbesondere das spezifische Herstellen eines Kontakts zwischen den fusionie-renden Membranen, auch Priming oder Docking genannt, werden je nach Prozess von ganz verschiedenen Proteinen kontrolliert. Bei der neuronalen Exozytose stabilisieren die Priming-Faktoren das Vesikel in einem hochfusogenen Zustand und binden es eng an die Plasmamembran. So kann das Vesikel beim Eintreffen des Ca(2+)-Signals in weniger als 100 µs mit der Membran verschmelzen und den Neurotransmitter ausschütten.Um den Einfluss verschiedener Faktoren auf diesen komplizierten Mechanismus zu verstehen, ist es sinnvoll, einzelne Regulatoren isoliert in einem artifiziellen System zu untersuchen. Dafür werden seit vielen Jahren SNARE-Proteine in fluoreszenzmarkierte Liposomen rekonstituiert und die Membranfusion über die Änderung der Fluoreszenzintensität beim Vermischen der Lipide beobachtet. In diesem Assay ist aber nur der letzte Schritt des Fusionsprozesses, das Verschmelzen der Membranen, zu beobachten. Davorliegende Schritte, vor allem das Herstellen eines stabilen Kontaktes zwischen den Liposomen, können nicht detektiert werden. Es fehlt also ein grundsätzliches Verständnis für die Intermediate, die bei dieser Fusionsreaktion auftreten. Ohne dieses Verständnis ist es aber unmöglich, den Einfluss verschiedener Faktoren, wie z.B. der zugesetzten regulatorischen Proteinen, der Membranzusammensetzung und krümmung oder der Art der Transmembrandomänen der Fusionsproteine zu klären.In der vorliegenden Arbeit wurde der Liposomen-Assay mit Hilfe von Einzelpartikelde-tektion weiterentwickelt. Die zur Markierung der Liposomen verwendeten FRET-Farbstoffe wurden auf die beiden zu fusionierenden Liposomen-Populationen verteilt. Die Liposomen wurden mit einem Konfokalmikroskop vermessen, was sowohl eine Fluoreszenzlebensdauer- wie auch eine FCCS (Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie)-Analyse erlaubt. So kann das Verschmelzen der Membranen als ein Absinken der Fluoreszenzlebensdauer des FRET-Donors beobachtet werden, während die Korrelation zwischen grünen und roten Fluoreszenzsignalen eine Aussage darüber zulässt, ob die Liposomen miteinander interagieren. Aus der simultanen Messung von Fluoreszenzlebensdauer und Kreuzkorrelation-Amplitude lässt sich so die relative An-zahl an interagierenden und fusionierten Teilchen messen, und daraus die relative Zahl der gedockten Liposomen bestimmen. Aus der Bestimmung der Teilchenzahlen in einer Autokorrelationsanalyse kann außerdem die Anzahl der Fusionsrunden berechnet werden.Hier wurde die Fusion von Liposomen untersucht, die mit den neuronalen Q-SNAREs SNAP-25A und Synatxin 1A bzw. dem neuronalen R-SNARE Synaptobrevin 2 rekons-tituiert waren. Der Q-SNARE-Komplex war mit einem Fragment des Synaptobrevin 2 stabilisiert, um die Bildung eines inerten Komplexes aus SNAP-25A und zwei Syntaxin 1A-Molekülen zu unterbinden. Die Ergebnisse zeigen, dass am Anfang der Fusions-reaktion bis zu 50 % der Liposomen einen gedockten Zustand eingehen. Dies ist im Einklang mit einem kinetischen Modell, bei dem der Übergang vom gedockten Zustand zu den fusionierten Membranen geschwindigkeitsbestimmend ist. In der hier vorliegen-den Arbeit ist dies wahrscheinlich auf die Verdrängung des stabilisierenden Synaptobrevin 2-Fragmentes zurückzuführen. Für Liposomen mit einem größeren Durchmesser ist eine deutlich reduzierte Membranspannung zu erwarten. Bei Verwendung dieser Liposomen ist in den hier gezeigten Experimenten die Fusionsgeschwindigkeit deutlich herabgesetzt, während die Docking-Geschwindigkeit vergleichbar bleibt. Im Durchschnitt durchlaufen die hier verwendeten Liposomen zwei Fusionsrunden.Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss eines wichtigen Regulators der neuronalen Exozytose, des Complexin, auf die Fusion von Liposomen untersucht. Complexin wird als Stabilisator für ein spätes Fusionsintermediat der neuronalen Exozytose, den primed Zustand, diskutiert. Ein solch stabilisierender Effekt konnte mit dem hier entwickelten Assay nicht gezeigt werden. Der zu erwartende Anstieg der Anzahl von gedockten Liposomen und das Absinken der Fusionsgeschwindigkeit konnten nicht beobachtet werden. Der Einfluss des Complexins war eher schwach beschleunigend. Dies wurde auf die Fähigkeit des Complexins zurückgeführt, die fusionierenden Membranen über eine Interaktion seines C-Terminus zu vernetzen.