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Oxygen-dependent regulation of the activating transcription factor-4 (ATF-4)

dc.contributor.advisorBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorWottawa, Marieke Claudiade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:52:57Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:35Zde
dc.date.issued2010-01-21de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD8D-0de
dc.description.abstractDie Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Enzyme 1-3 (PHD1-3) sind maßgeblich an der Regulation der Proteinstabilität der alpha-Untereinheit des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) beteiligt, welcher als wichtigster Transkriptionsfaktor der Sauerstoff-abhängigen Genexpression angesehen wird. Des Weiteren sind die PHDs auch an der Regulation Sauerstoff-abhängiger, aber HIF-unabhängiger Prozesse beteiligt. Zusätzlich sind vermehrt Hinweise für Isoform-spezifische Eigenschaften der PHDs gefunden worden. Aus diesen Gründen wurde im Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie ein Yeast-two hybrid Screen durchgeführt, mit dessen Hilfe neben anderen Faktoren der aktivierende Transkriptionsfaktor-4 (ATF-4) als neuer Isoform-spezifischer PHD3-Interaktionspartner identifiziert worden ist. Im Gegensatz dazu konnte keine Interaktion von ATF-4 mit PHD1 oder PHD2 sowie dem HIF-inhibierenden Faktor (FIH) nachgewiesen werden. ATF-4 ist an der Regulation der zellulären Stressantwort beteiligt und seine Expression wird wiederum durch verschieden Arten von Stress induziert. Weiterhin ist gezeigt worden, dass ATF-4 posttranslationell und auf Ebene der Proteinstabilität reguliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun erstmals die Sauerstoff-abhängige Regulation der ATF-4-Stabilität untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Hypoxie oder die Runterregulation der PHD3 mRNA Expression, nicht aber Normoxie oder die Verminderung der PHD2 mRNA Expression zu erhöhten ATF-4-Proteinleveln führt. Diese Regulation erfolgt zudem HIF unabhängig. Reoxygenierungsexprimente zeigten, dass durch Inhibierung der PHD Aktivität mittles DMOG-Behandlung oder durch spezifische Runterregulation der PHD3 mRNA Expression der Abbau des ATF-4-Proteins im Vergleich zu normoxischen Bedingungen verlangsamt war. So konnte in der ATF-4-Sequenz auch eine Sauerstoff-abhängige Degradierungsdomäne (ODD) identifiziert werden, die an der Regulation von ATF-4 beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PHD3-abhängige normoxische Degradation von ATF-4 durch das Ubiquitin-Proteasom-System vermittelt wird. Bezüglich der ATF-4 Degradation durch das Ubiquitin-Proteasom-System wurde die Beteiligung der Ubiquitin-E3-Ligase beta-Transductin repeat containing protein (ß TRCP) nachgewiesen. Allerdings konnte mit Hilfe von Pull-down Experimenten oder durch Runterregulation der ß-TRCP mRNA Expression gezeigt werden, dass die normoxische Degradation von ATF-4 nicht ß-TRCP-abhängig ist. Auch eine Beteiligung der E3-Ubiquitin-Ligase von-Hippel Lindau Faktor (pVHL) konnte ausgeschlossen werden. Daher sind weitere Studien sind notwendig, um die Ubiquitin-E3-Ligase zu identifizieren, welche für die normoxische Degradation von ATF-4 verantwortlich ist. In weiteren Versuchen konnten durch Untersuchung der Expression von ATF-4-Zielgenen erste Hinweise erhalten werden, dass in Hypoxie stabilisiertes ATF-4 an der Regulation von Zellschicksalsentscheidungen beteiligt ist. Dieses Wissen über den Einfluss der PHDs auf zusätzliche Regelwege, neben der Regulation von HIF, ist für die Entwicklung klinischer Anwendungen von PHD-Inhibitoren von großem Nutzen. So könnten diese Inhibitoren für die Behandlung von Anämien genutzt werden oder sie könnten wegen ihres cytoprotktiven Effekts gegen Gewebeschäden Anwendung finden.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleOxygen-dependent regulation of the activating transcription factor-4 (ATF-4)de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedSauerstoff-abhängige Regulation des Aktivierenden Transkriptionsfaktors-4 (ATF-4)de
dc.contributor.refereeMelchior, Frauke Prof. Dr.de
dc.date.examination2009-10-23de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengThe prolyl-4 hydroxylase domain enzymes 1-3 (PHD1-3) are involved in regulating the protein stability of the alpha subunit of the hypoxia inducible factor (HIF), which is the master regulator of oxygen-dependent gene expression. Increasing evidence has been found that the PHDs are involved in regulating additional, HIF-independent, oxygen-dependent signal transduction pathways. Additionally, several hints for isoform-specific functions of the PHDs were observed. Therefore, members of the Department of Cardiovascular Physiology performed a yeast two-hybrid screen in which the activating transcription factor-4 (ATF-4) was identified as a novel interaction partner of the oxygen sensor PHD3. ATF-4 is involved in the cellular stress response and its expression is shown to be induced by different stress signals. ATF-4 is also regulated by phosphorylation and at the level of protein stability. In this thesis the oxygen-dependent regulation of the ATF-4 stability was characterized. Yeast two-hybrid assays revealed the isoform specificity of this interaction. The interaction of ATF 4 is restricted to PHD3 whereas no interaction was observed with PHD1, PHD2 or factor inhibiting HIF-1 (FIH). Furthermore, exposure to hypoxia or silencing PHD3 mRNA expression, but not PHD2 expression, resulted in increased ATF-4 proteins levels compared to normoxia in a HIF-independent manner. Reoxygenation experiments revealed a slower degradation of the ATF-4 protein after inhibiting PHD activity by DMOG treatment or silencing PHD3 expression, indicating the involvement of PHD3 in regulating ATF-4 protein stability. A newly identified oxygen dependent degradation (ODD) domain in the ATF-4 protein sequence is responsible for the oxygen-dependent ATF-4 protein stability. A degradation of ATF-4 by the ubiquitin-proteasome system mediated by the ubiquitin E3 ligase SCF beta-transducin repeat containing protein (ß-TRCP) has been described earlier, but its function for the normoxic degradation of ATF-4, was not known. This thesis shows that the normoxic destabilisation of ATF-4 is mediated via PHD3-dependent degradation by the ubiquitin-proteasome system. However, pull-down assays and silencing ß-TRCP expression by siRNAs showed that the normoxic degradation of ATF-4 is not mediated by the E3 ligases ß-TRCP or von-Hippel Lindau tumor suppressor (pVHL). Therefore further studies will be needed to identify the E3 ligase responsible for the normoxic degradation of ATF-4. Studies of ATF-4 target gene expression under hypoxia revealed an involvement of oxygen-dependent ATF-4 regulation in cell fate decision. This knowledge of PHD regulated pathways can be helpful for the development of clinically applicable small molecule PHD inhibitors that can be used for the treatment of anemia or that may be applied because of their cytoprotective effects in damaged tissues.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerATF-4de
dc.subject.gerHypoxiede
dc.subject.gerPHD3de
dc.subject.gerProteasomde
dc.subject.gerβ-TRCPde
dc.subject.engATF-4de
dc.subject.enghypoxiade
dc.subject.engPHD3de
dc.subject.engproteasomede
dc.subject.engβ-TRCPde
dc.subject.bk42de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2352-9de
dc.identifier.purlwebdoc-2352de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWde
dc.identifier.ppn620659025de


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