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Biochemische, molekularbiologische und genetische Untersuchungen über strukturelle Voraussetzungen für DNA U-Endonukleaseaktivität in der ExoIII-Familie von DNA Reparaturenzymen

dc.contributor.advisorFritz, Hans-Joachim Prof. Dr.de
dc.contributor.authorBer, Svetlanade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:53:04Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:36Zde
dc.date.issued2010-03-05de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD98-5de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-346
dc.description.abstractEins der gravierendsten Probleme in jedem Organismus sind die spontane hydrolytische DNA-Schäden. Das Problem der DNA-U-Reparatur wurde bis heute sorgfältig in thermophilen und hyperthermophilen Archaeen untersucht. Dabei wurde ein neuartiger Reparaturweg entdeckt, der von einer DNA-U Endonuklease (Mth212, ein ExoIII Homolog) initiiert wird. Zum besseren Verständnis des möglichen evolutiven Weges der DNA-U-Reparatur sowie für die Aufklärung der Fragen, ob dieser Reparaturweg von den extremen Lebensbedingungen abhängig ist und welche strukturelle Besonderheit die U-Endonukleaseaktivität von Mth212 bestimmt, wurde ein mesophiles ExoIII-Homolog (Mma3148) mit hoher Sequenzverwandtschaft zu Mth212 untersucht. Das ExoIII-Homolog Mma3148 stammt aus dem mesophilen Archaeon Methanosarcina mazei. Die Untersuchung des Genoms von M. mazei hat folgende Ergebnisse geliefert. M. mazei ist mit zwei open reading frames ausgestattet, deren Produkte als Kandidaten für die Initiation der DNA-U-Reparatur betrachtet werden können: ein TUDGA-Homolog (Mma0486) (Familie 4) und ein ExoIII-Homolog (Mma3148). Das TUDGA-Homolog besitzt alle Eigenschaften der Uracil-DNA-Glykosylase Familie 4. Es ist allerdings erstaunlich, dass das Protein von 37°C bis zu 77°C aktiv bleibt. Mma3148 hat die typischen Eigenschaften eines ExoIII-Homologs. Zusätzlich zeigt das Protein Aktivität gegenüber biologisch irrelevanten U/T und U/C Fehlpaarungen, nicht aber gegenüber U/G. Aufgrund der Analyse eines multiple sequence alignments von Mth212 mit der ExoIII-Familie und der 3D Struktur bereits kristallisierter ExoIII-Enzyme wurden bei M. mazei ExoIII zwei Aminosäuren ausgetauscht, was zur generellen Steigerung aller Aktivitäten und damit zu einer schwachen, aber deutlich detektierbaren Aktivität gegenüber U/G geführt hat. Für die Untersuchung, ob die Doppelmutante genetisch nachweisbar einen DNA-U-Reparaturweg in vivo einleiten kann, wurde ein U-DNA-Reparaturexperiment in vivo im heterologen E. coli-Hintergrund mit Hilfe eines M13-heteroduplex-DNA-Konstruktes durchgeführt. Zuerst wurde mit Hilfe eines Komplementationsexperimentes gezeigt, dass das archaeelle Protein in E. coli funktionsfähig ist. Das U-DNA-Reparaturexperiment hat einen schwachen Hinweis auf Beteiligung der Doppelmutante an der U/G-Reparatur ergeben. In Zusammenarbeit mit Kristina Lakomek wurde die Arbeitshypothese zur Erkennung des Uracilrests durch Mth212 durch Austausch bestimmter Aminosäurereste untersucht. Daraus wurde folgende Schlussfolgerung gezogen: Die Insertion einer Argininseitenkette (Arg209) in die Basenstapelung spielt vermutlich eine entscheidende Rolle bei der Erkennung eines dU-Restes. Im Licht dieser Befunde wurde die Evolution der DNA-U-Reparatur in der archaeellen Domäne folgenderweise betrachtet: Die DNA-U-Reparatur wurde ursprünglich von einem ExoIII-Homolog ausgeführt, dessen U-Endoaktivität durch den evolutiv späteren Erwerb eines TUDGA-Homologs überflüssig wurde und anschließend durch genetische Drift verloren ging. Da das Mma3148 Protein nur biologisch nicht relevante U-Aktivität besitzt, wurde dieses Enzym als eine evolutive Zwischenstufe betrachtet.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleBiochemische, molekularbiologische und genetische Untersuchungen über strukturelle Voraussetzungen für DNA U-Endonukleaseaktivität in der ExoIII-Familie von DNA Reparaturenzymende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedBiochemical, molecular biological and genetic studies on structural requirements for DNA U-Endonuclease activity in the ExoIII family of DNA repair enzymesde
dc.contributor.refereeKramer, Wilfried PD Dr.de
dc.date.examination2010-01-19de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengOne of the most serious problems in any organism is the spontaneous hydrolytic DNA damage. The problem of U-DNA repair is being intensively studied in thermophilic and hyperthermophilic archaea. A novel repair path, initiated by a DNA-U-endonuclease (Mth212, an ExoIII homologue) was discovered. To elucidate the possible evolutionary pathway of this DNA-U repair, and to shed light on the questions whether this repair path depends on the extreme conditions, and which structural features determine endonuclease activity of Mth212, a mesophilic ExoIII homologue (Mma3148), which has high sequence similarity to Mth212 was studied. The ExoIII homologue Mma3148 comes from the mesophilic archaeon Methanosarcina mazei. The investigation of genome of M. mazei has delivered following results. M. mazei is equipped with two open reading frames whose products may be considered as a candidates for the initiation of DNA-U-repair: a TUDGA homologue (Mma0486) (family 4) and an ExoIII homologue (Mma3148). The TUDGA homologue possesses all the properties of uracil-DNA glycosylase from family 4. However, it is surprising that the protein is active at 37 ° C upto 77 ° C. Mma3148 has typical characteristics of an ExoIII-homologue. In addition, the protein shows activity against biologically irrelevant U / T and U / C mismatches, but not against U / G. Based on the analysis of multiple sequence alignments of Mth212 with other ExoIII family members and the 3D structures of crystallized ExoIII homologues, two amino acids in M. Mazei ExoIII were replaced, which has contributed to the overall increase of all activities and to a weak but clearly detectable activity against U / G mispair. To investigate whether the double mutant can initiate genetically detectable DNA-U-repair path in vivo, U-DNA repair in vivo experiment in heterologous E. coli background was performed using an M13 heteroduplex DNA construct. At first, using a complementation experiment, it was shown that the archaeal protein is functional in E. coli. U-DNA repair experiment showed a weak indication of involvement of the double mutant in the U / G repair. In collaboration with Kristina Lakomek, the working hypothesis of the recognition of uracil by Mth212 was investigated by exchanging certain amino acid residues. Basing on the results it was concluded that the insertion of an arginine side chain (Arg209) in the DNA base stack probably plays a crucial role in the detection of dU residues. In light of these findings, the evolution of DNA-U-repair in the archaeal domain was considered following way: The DNA-U-repair was initially performed by an ExoIII homologue, whose U-endoactivity became later redundant through the subsequent acquisition of an evolutionary homolog of TUDGA and therefore was lost by genetic drift. Since the Mma3148 protein possesses biologically nonrelevant U-activity, this enzyme has been regarded as an evolutionary intermediate.de
dc.contributor.coRefereeHoppert, Michael PD Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeMühlenberg, Michael Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerDNA U-Endonukleasede
dc.subject.gerDNA-U-Reparaturde
dc.subject.gerCytosin-Desaminerungde
dc.subject.gerExoIIIde
dc.subject.gerMma3148de
dc.subject.engDNA U-Endonucleasede
dc.subject.engDNA-U-repairde
dc.subject.engcytosine deaminationde
dc.subject.engExoIIIde
dc.subject.engMma3148de
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2402-7de
dc.identifier.purlwebdoc-2402de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWJL 100: DNA, RNA, Replikation {Biologie, Genetik}de
dc.identifier.ppn62982990Xde


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