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Investigations into the mode of action of the DNA uridine endonuclease Mth212 of Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH

dc.contributor.advisorFritz, Hans-Joachim Prof. Dr.de
dc.contributor.authorCiirdaeva, Elenade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:53:05Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:36Zde
dc.date.issued2010-03-05de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AD99-3de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-347
dc.description.abstractDie spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin zu Uracil ist eine der häufigsten DNA-Modifikationen während des zellulären Stoffwechsels. Um dieser mutagenen Wirkung zu widerstehen, entfernen die meisten Organismen Uracil-Reste aus der DNA mittels Basen-Exzisionsreparatur (BER). Diese wird von einer spezifischen Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) eingeleitet. UDGasen sind hoch konservierte und weit verbreitete DNA-Reparaturenzyme, die in fast allen lebenden Organismen vorhanden sind. Auffällig ist allerdings das Fehlen jeglicher Gene der UDG-Familie in Methanothermobacter thermautotrophicus, einem thermophilen Archaeon. Mth212 von M. thermautotrophicus ist das einzige Homolog der ExoIII-Familie, das neben allen ExoIII-Aktivitäten, eine Uridin-Endonuklease-Aktivität besitzt. Mth212 erkennt Uracil in dsDNA und spaltet die Phosphodiesterbindung auf der 5"-Seite des 2 dU-Restes, wobei ein Einzelstrangbruch entsteht. Das Ziel dieses Projekts war es, einen Einblick in den Mechanismus der spezifischen Substraterkennung durch Mth212 sowie die strukturellen Eigenschaften, die diese Erkennung ermöglichen, zu gewinnen. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein konservierter Abspartat-Rest (Asp-151) in Mth212 durch Asparagin (D151→N) ersetzt. Die Mth212/D151N Mutante wurde bezüglich enzymatischer Aktivität und Substratbindung analysiert. Die D151→N Substitution schaltet sowohl die AP- als auch die U-Endonukleaseaktivität aus, hat aber keinen Einfluss auf die Fähigkeit des Enzyms zur Substratbindung. Diese Daten zeigen, dass Mth212 ein einzelnes katalytisch aktives Zentrum für beide genannten Endonukleaseaktivitäten besitzt. Die Beibehaltung der Substrat-bindenden Eigenschaften deutet auf korrekte Faltung der Mth212/D151N-Mutante hin. Die Analyse der Affinität von Mth212/D151N zu verschiedenen dsDNA-Substraten mit einer AP-Stelle oder U/X-Basenopposition (X: Py oder Pu) ergab folgende Abnahme der Bindungsstärken: AP-Stelle>DNA-Enden [mit 5 Überhang oder blunt]>U/Py>U/Pu. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mth212 in vitro ein DNA-Substrat entweder in Endo- oder Exo-Modus binden kann. Es ist sehr wahrscheinlich, dass der Modus der Substratbindung sowohl die Stärke der Substratbindung als auch die Wirksamkeit der Gesamtreaktion bestimmt. Mth212 spaltet verschiedene U/X-Basenoppositionen mit unterschiedlichen Präferenzen. Die U/Py-Basenoppositionen werden schneller gespalten als solche mit Purinen. Somit korreliert die Substratspaltungsrate mit den Substratbindungsstärken. Diese Besonderheit der enzymatischen Aktivität kann auf die unterschiedlichen Basenpaarungseigenschaften der verschiedenen U/X-Basenoppositionen zurückzuführen sein, da diese die energetischen Kosten für das Flipping-out des Uracilrestes aus dem DNA-Basenstapel beeinflussen. Darüber hinaus spricht der beobachtete Unterschied in der Substratspaltung dafür, dass das Flipping-out der Base der geschwindigkeitslimitierende Faktor der Gesamtreaktion von Mth212 ist. Auf Grundlage der Ergebnisse der Bindungsstudien und der Untersuchung der Substratspaltung wurde ein Nucleotide-flipping-Mechanismus für die Erkennung und Prozessierung des Uracils vorgeschlagen. Bei der kristallographischen Analyse von Mth212/D151N im Komplex mit spezifischen DNA-Substraten lag in allen Protein-DNA Komplexen ein exo-Bindungsmodus vor, wobei eines der 3"-Enden der DNA-Substrate im aktiven Zentrum fixiert war. Da freie DNA-Enden in vivo selten auftreten, ist es sehr wahrscheinlich, dass Mth212 ähnlich wie andere schadenspezifische DNA-Reparatur-Enzyme an einer zufälligen Position an die DNA bindet und dann an ihr entlanggleitet, bis das Enzym auf eine Läsion trifft, diese spezifisch bindet und repariert.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleInvestigations into the mode of action of the DNA uridine endonuclease Mth212 of Methanothermobacter thermautotrophicus ΔHde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedUntersuchungen über die Wirkungsweise der DNA-Uridin Endonuklease Mth212 aus Methanothermobacter thermautotrophicus ΔHde
dc.contributor.refereeKramer, Wilfried PD Dr.de
dc.date.examination2010-01-22de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengSpontaneous hydrolytic deamination of cytosine to uracil is one of the most frequent DNA modifications during cellular everyday metabolism. To counteract this mutagenic effect, most organisms eliminate uracil residues from DNA by means of the base-excision repair pathway (BER), which is initiated by a specific uracil-DNA glycosylase enzyme (UDG). UDGs are highly conserved and widespread DNA repair enzymes that are found in almost all living organisms. The most striking is perhaps the lack of UDG family genes in Methanothermobacter thermautotrophicus, a thermophilic Archaeon, suggesting an alternative DNA uracil repair system. Mth212 from M. thermautotrophicus is the only enzyme within ExoIII family members, which besides all enzymatic activities inherent in ExoIII homologues recognises uracil in ds DNA and cleaves the phosphodiester linkage located to the 5 side of 2 dU residue. The purpose of this project was to gain an insight into the mode of Mth212 specific substrate recognition and structural features providing Mth212 with uracil specificity. To address this, a conserved Asp-151 residue in Mth212 was substituted for Asn (D151→N). Mth212/D151N mutant was purified and analysed in vitro for enzymatic activity and substrate binding properties. D151→N substitution eliminated both AP-endo and U-endonuclease activities but did not influence the substrate binding. These data indicate that Mth212 has a single catalytic active site for both AP-endo and U-endonuclease activities. Furthermore, retention of the substrate binding properties provides evidence for the proper folding of Mth212/D151N mutant protein. Analysis of D151N binding to the ds DNA substrates containing ether an AP-site or U/X oppositions (X: Py or Pu base type) revealed the following decrease in substrate binding strength: AP-site > DNA ends [3 recessed or blunt ends] > U/Py > U/Pu. These results suggest that in vitro Mth212 can bind DNA substrate in either endo- or exo-binding mode. It is most likely that the mode of substrate binding determines the strength of substrate binding and the efficacy of the overall enzymatic reaction. The data on wt Mth212 substrate cleavage efficiency show that wt Mth212 processes different U/X oppositions with different preferences at the early stages of enzymatic reaction. U/Py base oppositions were cleaved faster than U/Pu and the order of substrate cleavage rates reflected the order of substrate binding strengths. Such mode of enzymatic activity can be attributed to the difference in base pairing properties of various U/X oppositions and to the energetic costs required for the extruding of the target uracil from DNA base stack. Moreover, the observed difference in substrate cleavage rates, in correlation with the energy requirements, argues for the base flipping-out as a rate-limiting factor in the overall enzymatic reaction. Based on binding assays and in substrate cleavage results a putative nucleotide-flipping mechanism for the uracil-containing mismatch discrimination and processing was proposed. The crystallographic analysis of Mth212/D151N in complex with specific DNA substrates revealed all Protein-DNA complexes in form of exo-binding mode, where one of the 3 ends of DNA duplex is fixed in the active site. Since free DNA ends in vivo is a rare event, it is more likely that Mth212, similar to other damage-specific DNA repair enzymes, binds DNA distortion unspecifically building a transient complex and slides along DNA strand until the target mismatch is encountered.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeIrniger, Stefan PD Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerCytosin-Desaminerungde
dc.subject.gerthermophiles Archaeonde
dc.subject.gerUridin-Endonukleasede
dc.subject.gerUridin-Reparaturde
dc.subject.engcytosine deaminationde
dc.subject.engthermophilic archaeonde
dc.subject.enguridin endonucleasede
dc.subject.enguridine repairde
dc.subject.bk4213de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2403-2de
dc.identifier.purlwebdoc-2403de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWJL 100: DNA, RNA, Replikation {Biologie, Genetik}de
dc.identifier.ppn642414637de


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