Identifizierung von Chitinasen mit fungizider Wirkung

Abstract

Bei Chitin handelt es sich um ein lineares unlösliches Polymer aus β-1,4-N-Acetyl-D-Glukosamin-Einheiten. Diese hochpolymere Verbindung ist nach Cellulose das am häufigsten vorkommende Biopolymer der Erde und dient in unterschiedlichen Organismen wie den Crustaceae, Protozoen, Pilzen und den meisten Arthropoden als Gerüstsubstanz. Die auf natürliche Weise entstehenden großen Mengen an Chitin werden durch die in Flora, Fauna und unter den Mikroorganismen verbreiteten chitinspaltenden Enzyme abgebaut. Chitinasen sind in 3 Familien der Glykosyl-Hydrolasen eingeordnet (18, 19 und 20). Viele Chitinasen, darunter auch bakterielle, können an chitinhaltige Pilzmycelien binden und anschließend Chitin abbauen; eine damit verbundene wachstumshemmende Wirkung auf den Pilz ist die Folge. Daher erscheinen bakterielle Chitinasen für den Einsatz als Fungizid geeignet. Der Einsatz von Chitinasen als Fungizid erscheint entgegen der Verwendung vieler synthetischer Fungizide unbedenklich, da diese biologische Agentien darstellen, die vollständig abbaubar sind und nur Chitin enthaltende Organismen angreifen. Identifizierte Chitinasen mit fungizider Wirkung könnten im Nutzpflanzenbau zur Bekämpfung phytopathogener Pilze eingesetzt werden.Ziel der Arbeit war es, bakterielle Chitinasen mit fungizider Wirkung zu identifizieren. Dafür wurden zwei Strategien verwendet: 1.) Es wurden auf dem klassischen Wege Chitinase-produzierende Mikroorganismen angereichert, isoliert und Genbänke in Escherichia coli erstellt. Diese wurden mit Hilfe der Koloniehybridisierung auf das Vorhandensein von Chitinasegenen durchsucht 2.) Chitinasegene wurden direkt aus Anreicherungskulturen mittels PCR amplifiziert.Um chitinolytische Bakterien zu isolieren, wurden Boden- und Meeres-Proben von unterschiedlichen Standorten verwendet und in Mineralmedium mit Chitin als einziger Kohlenstoffquelle inkubiert. Fünf der dreizehn isolierten Bakterienstämme zeigten antifungale Eigenschaften und konnten nach 16S rRNA-Analyse in die Gattungen Bacillus und Streptomyces eingeordnet werden.Fünf Chitinasegene wurden kloniert. Davon konnten zwei Gene über E. coli expremiert und die Genprodukte gereinigt werden. Diese Enzyme wurden charakterisiert und zeigten fungizide Eigenschaften gegen phytopathogene Pilze.