Regulation of glucosamine-6-phosphate synthase synthesis by a hierarchical acting cascade composed of two small regulatory RNAs in <i>Escherichia coli</i>.

Abstract

Aminozucker sind essentiell für die Biosynthese der bakteriellen Zellwand und der Lipopolysaccharide. Das Enzym Glukosamin-6-Phosphat Synthase katalysiert die Bildung von Glukosamin-6-Phosphat (GlcN6P) aus Fruktose-6-Phosphat und Glutamin. Dies ist der erste Schritt der Aminozuckerbiosynthese. In Escherichia coli wird GlmS zusammen mit dem Enzym GlmU im bi-cistronischen glmUS Operon kodiert. Während die enzymatische Aktivität von GlmU immer benötigt wird, braucht die Zelle GlmS nur dann, wenn keine externe Aminozuckerquelle zur Verfügung steht. Dennoch werden beide Gene kotranskribiert. so dass es bisher unbekannt war, wie eine differenzierte Expression von glmU und glmS erreicht wird. Wie dies geschieht, wird in dieser Arbeit gezeigt. Im Anschluss an die Transkription wird das glmUS Kotranskript innerhalb des glmU-Stopp-Kodons von RNase E geschnitten. Hierdurch entsteht ein monocistronisches glmS-Transkript. Die Menge dieses glmS-Transkripts wird in Antwort auf eine intrazelluläre Limitierung von GlcN6P durch einen Rückkopplungsmechanismus reguliert. Für diese Regulation sind die beiden kleinen RNAs GlmY und GlmZ erforderlich. GlmY und GlmZ sind sowohl in ihrer Sequenz als auch in ihrer Sekundärstruktur homolog und sie bilden eine Kaskade, welche die glmS Expression aktiviert. Wenn die GlcN6P Menge abnimmt, akkumuliert GlmY in der Zelle und verhindert die RNase E abhängige Prozessierung von GlmZ. Nur die unprozessierte Form von GlmZ ist in der Lage, mit dem glmS Transkript zu basenpaaren. GlmZ paart mit Hilfe von Hfq mit der linken Halbseite einer Stamm-Schlaufen-Struktur. Diese Stamm-Schlaufen-Struktur verhindert die Bindung von Ribosomen an die Shine-Dalgarno Sequenz, so dass diese Interaktion die inhibitorische Stamm-Schlaufen-Struktur zerstört und eine effiziente Translation von glmS ermöglicht. Außerdem zeigen die Daten, dass das Protein YhbJ eine Rolle in diesem Prozess spielen könnte. In einer ΔyhbJ Mutante wird GlmZ nicht mehr prozessiert und glmS akkumuliert in sehr großen Mengen. Daher erscheint es sinnvoll, dass YhbJ ein intermediärer Faktor in der GlmY/GlmZ Kaskade sein könnte, der zwischen GlmY und GlmZ einzuordnen ist und die GlmZ-Prozessierung GlmY-abhängig reguliert. Sowohl die Expression als auch die Menge an GlmY in der Zelle ist sehr stark reguliert. GlmY wird ständig von der Poly(A)polymerase für den Abbau durch die Polynukleotid Phosphorylase markiert. Hierdurch wird GlmY ständig aus der Zelle entfernt, um das System sensitiv für das GlcN6P Level zu halten. Das Gen glmY wird von zwei überlappenden σ70- und σ54-Promotoren exprimiert. Beide Promotoren initiieren die Transkription an demselben Nukleotid, so dass von beiden Promotoren aus die identischen GlmY-Spezies gebildet werden. Der σ70-anhängige Promotor ist hauptsächlich während der expotentiellen Wachstumsphase aktiv, wohingegen der σ54-abhängige Promotor während der stationären Phase aktiver ist. Der σ70-abhängige Promotor scheint konstitutiv aktiv zu sein. Im Gegensatz dazu wird der σ54-abhängige Promotor vom GlrR/GlrK Zwei-Komponenten System und YhbJ reguliert. GlrR ist ein σ54-abhängiges Aktivator Protein und es wird gezeigt, dass es an drei spezifische Bindestellen mit dem Konsensus TGTCN10GACA stromaufwärts der glmY Promotor Region bindet. Die Aktivität des σ54-abhängigen Promotors is völlig abhängig vom Vorhandensein von GlrR und ist in einer ΔyhbJ Mutante vermindert. Dieser Effekt ist unabhängig von GlmY und GlmZ. Der Mechanismus der YhbJ-abhängigen Modulation der Aktivität des glmY σ54-Promotors ist unbekannt. Die Aktivität des glmY-Promotors verändert sich nicht in Antwort auf GlcN6P Mangel. Daher muss das GlcN6P Signal nach der Transkription von glmY wahrgenommen werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, wie wie die differenziell e Expression des bi-cistronischen glmUS Operons durch post-transkriptionelle Regulation der glmS Expression durch zwei homologe sRNAs, GlmY und GlmZ, erreicht wird. Diese sRNAs bilden eine Kaskade und sind das erste Beispiel für hierarchisch arbeitende sRNAs. Außerdem zeigt diese Arbeit das erste Beispiel für überlappend kodierte σ70- und σ54-abhängige Promotoren, die die Transkription an demselben Nukleotid initiieren.