Untersuchung der Expression und Aktivität des Molybdän-Eisen Protein in Wolinella succinogenes

Abstract

Nitrogenase ist das einzige bekannte enzymatische System, welches die stabile Dreifachbindung von N2 unter Normalbedingungen zu spalten vermag, um Ammoniak zu bilden. In der Industrie wird dies im Haber-Bosch-Prozess, bei dem hohe Temperatur und Druck benötigt werden, realisiert. Obwohl der Haber-Bosch Prozess zurzeit der einzige bekannte Prozess ist, um fixierten Stickstoff verfügbar zu machen, bringt er viele Probleme mit sich, vor allem im Bezug auf Umweltverschmutzung und Energieverbrauch. Deshalb wären effizientere Katalysatoren nach dem Prinzip der Nitrogenase sehr erstrebenswert. Dies wäre auch von großer Bedeutung für die moderne Industrie, da weniger Energie benötigt und die Umwelt geschont würde. Das zur Fixierung molekularen Stickstoffs befähigte Enzymsystem Nitrogenase besteht aus zwei Proteinen, der Dinitrogenase Reduktase (oder Eisen-Protein) und der Dinitrogenase (oder Molybdän-Eisen-Protein). Mehrere Strukturen der Nitrogenase-Komponenten von verschiedenen Mikroorganismen wurden in den letzten zwei Jahrzehnten gelöst und kürzlich berichteten Einsle et al. von einem neuen Modell des aktiven Zentrums, mit einer verbesserten Auflösung von 1,16 Å, welches ein internes, sechsfach koordiniertes leichtes Atom im FeMo-Cofaktor enthält. Dennoch sind mechanistische Details wie die Distickstoff-Dreifachbindung an dem einzigartigen Metall-Zentrum der Nitrogenase gebrochen wird noch nicht verstanden. Die Untersuchung des Nitrogenasesystems in verschiedenen Arten von Bakterien kann daher einen Beitrag zur Aufdeckung dieser rätselhaften Eigenschaften leisten. Bisher sind nur wenige Organismen dafür bekannt, dass sie nif Gene besitzen. Überraschend wurden solche Gene in einem Bakterium aus dem Pansen von Kühen, Wolinella succinogenes, gefunden. Hauptziel dieses Promotionsprojekts war die Nitrogenase von W. succinogenes, die in zwei parallelen Strategien bearbeitet wurde. Erstens wurde Azotobacter vinelandii, ein ausgiebig untersuchter Organismus, für Aktivitätsmessung und Reinigung des Nitrogenasesystems benutzt, um die Experimente zu kalibrieren. Als Methode zur Aktivitätsmessung wurde der klassische Nitrogenase-Acetylen-Reduktions-Assay, mit Hilfe von Gaschromatographie durchgeführt. Zusätzlich wurden andere analytische Methoden zur Charakterisierung des Enzyms angewendet, wie SDS-PAGE und Massenspektrometrie. Die zweite parallele Arbeitslinie war an W. succinogenes, das die nif Gene besitzt aber dessen Stickstofffixierungsfähigkeit noch nicht genau bekannt und die Art der Nitrogenase völlig unbekannt ist. Die anfänglichen Experimente deckten auf, dass W. succinogenes in stickstofflimitiertem Medium Nitrogenase zwar exprimiert, aber nicht diazotroph wächst. Der Nachweis einer Nitrogenaseaktivität war hier noch nicht voll aussagekräftig, da die Expressionsbedingungen sowie die effektive Stickstoffkonzentration im Medium noch nicht voll erfasst wurden. Daher wurden in Anschluss weitere Schritte zur Charakterisierung und Isolation der Nitrogenase durchgeführt. Das Enzym wurde aus Zellextrakten angereichert und per Massenspektrometrie identifiziert.