Investigation of glycolysis in Bacillus subtilis
Untersuchung der Glykolyse in Bacillus subtilis
by Nico Pietack
Date of Examination:2010-04-29
Date of issue:2010-05-19
Advisor:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Ingo Heilmann
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Size:4.25Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Bacillus subtilis is a model organism for Gram-positive bacteria and object for biotechnological applications. The extensive investigation of this bacterium makes it one of the best studied prokaryotes in terms of molecular and cell biology. However, a lot of issues are still open for the complete comprehension of this bacterium. The functions of various genes must be elucidated, as well as the role of posttranslational modifications. Among the posttranslation modifications the phosphorylation of proteins has a great regulatory potential. Recent studies revealed, that the phosphorylation of proteins on serine, threonine and tyrosine residues is widespread among bacteria, including Bacillus subtilis. The aim of this work was to investigate the origin and function of phosphorylation events on serine, threonine and tyrosine residues in B. subtilis. For this purpose, multiple kinase mutants were constructed and their phosphoproteomes were analysed. However, the phosphoproteome of these mutants remained unchanged. Hence, it was assumed that unknown kinases or other mechanism of phosphorylation must be responsible. Several approaches revealed that certain proteins are autophosphorylated. The conserved GTP-binding proteins Obg and YdiB were found as autophosphorylated in the presence of their substrates GTP and ATP, respectively. Furthermore, the phosphosugar mutases phosphoglycerate mutase (Pgm) and phosphoglucosamine mutase (GlmM) are also autophosphorylated on conserved serine residues. The autophosphorylation of these residues is part of their enzymatic activity and thus kinase independent. These results indicate that apparently not all phosphorylation events in B. subtilis are kinase dependent. However, completely new kinases can not be excluded, but are obviously not responsible for the entirety of phosphorylation events in B. subtilis. Hence, it must be summarized that autophosphosphorylation of proteins can occur during interaction with energy rich phosphate carriers and it also can be part of enzymatic activity. In B. subtilis, nearly all enzymes of glycolysis were found to be phosphorylated. In addition, previous studies described all genes that code for glycolytic enzymes as essential. However, in this work it was discovered that each glycolytic gene can be deleted and that even strains with combinations of mutations are still viable. Growth tests revealed, that single mutants of glycolytic genes are able to grow on minimal medium with glucose and malate. Moreover, the phosphofructokinase (ΔpfkA) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mutant (ΔgapA) grow with glucose as sole carbon source. For long time it was supposed that most of the glycolytic genes were essential for an unknown reason. This is the first time, that deletion mutants were constructed for each individual glycolytic gene of B. subtilis. Glycolytic mutants are a good basis for further studies in B. subtilis.
Keywords: Bacillus subtilis;glycolysis; phosphorylation
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Bacillus subtilis ist ein Modellorganismus für Gram-positive Bakterien mit Relevanz für die Biotechnologie. Die intensive Erforschung dieses Bakteriums macht es zu einem der am besten untersuchten Prokaryonten im Bereich der Molekular- und Zellbiologie. Obgleich dieses Bakterium gut untersucht ist, sind noch viele Fragen in Bezug auf Genfunktionen und posttranslationen Modifikationen offen. Unter den posttranslationen Modifikationen besitzen Proteinphosphorylierungen ein großes regulatorisches Potential. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die Phosphorylierung von Proteinen an Serin-, Threonin- und Tyrosin-Resten innerhalb der Bakterien weit verbreitet ist, so auch in Bacillus subtilis. Ziel dieser Arbeit war es, den Ursprung und die Funktion der Serin-, Threonin- und Tyrosin- Phosphorylierung in Bacillus subtilis näher zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Mehrfach- Kinasemutanten konstruiert und deren Phosphoproteome untersucht. Jedoch zeigten diese Mutanten keine Unterschiede im Phosphoproteom, verglichen mit dem Wildtyp. Deshalb wurde angenommen, dass unbekannte Kinasen oder andere Mechanismen der Phosphorylierung existieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Proteine, die sich autophosphorylieren, identifiziert. So wurde Autophosphorylierung der konservierten GTP-bindenden Proteine Obg und YdiB in Abhängigkeit von GTP bzw. ATP nachgewiesen. Außerdem konnte die Autophosphorylierung der essentiellen Mutasen, Phosphoglyceratmutase (Pgm) und Phosphoglucosaminmutase (GlmM) an konservierten Serin-Resten nachgewiesen werden. Die Autophosphorylierung dieser Enzyme ist Bestandteil ihrer enzymatischen Aktivität und somit unabhängig von Proteinkinasen. Diese Ergebnisse bestätigen die Vermutung, dass nicht alle Phosphorylierungsereignisse in B. subtils durch Proteinkinasen vermittelt werden, wobei die Existenz weiterer, unbekannter Proteinkinasen nicht ausgeschlossen werden kann. Proteine können somit auch in Folge der Interaktion mit energiereichen Phosphatträgern und enzymatische Aktivität phosphoryliert werden. In früheren Arbeiten wurden annähernd alle Gene die für die Enzyme der Glykolyse kodieren als essentiell eingestuft. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass jedes einzeln glykolytische Gen deletiert werden kann. Darüber hinaus ist es möglich Kombinationen dieser Mutanten zu konstruieren, die ebenfalls lebensfähig sind. In Wachstumsversuchen wurde gezeigt, dass die hergestellten Einzelmutanten auf Minimalmedium mit Glukose und Malat wachsen können. Für die Phosphofruktokinase Mutante (ΔpfkA) und die Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase Mutante (ΔgapA) wurde Wachstum mit Glukose als alleinige C-Quelle festgestellt. Aus unbekannten Gründen wurde lange Zeit angenommen, dass alle glykolytischen Gene essentiell seien. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Mutanten aller einzelnen glykolytischen Gene hergestellt. Diese Mutante bilden eine hervorragende Grundlage für weitere Studien über den Stoffwechsel von B. subtilis.
Schlagwörter: Bacillus subtilis;Glykolyse; Phosphorylierung