Metagenomanalysen von zwei Habitaten mit (hemi-)cellulolytischen mikrobiellen Gemeinschaften

Abstract

Die Analyse von Metagenomen ermöglicht nicht nur einen Einblick in die mikrobiellen Diversität eines Habitats, sie kann auch durch die Durchmusterung von Umweltgenbanken zu der Entdeckung von neuartigen, biotechnologisch anwendbaren Biokatalysatoren führen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die bakterielle Diversität in Darmabschnitten des europäischen Bibers (Castor fiber albicus) ermittelt, zum anderen erfolgte ein funktionelles Screening einer metagenomischen Fosmidgenbank auf Gene für Glykosidhydrolasen. Die Ermittlung der bakteriellen Diversität in dem Blinddarm und Dickdarm des europäischen Bibers erfolgte mit Hilfe von 16S rRNA-Genanalysen. Hierfür wurden die 16S rRNA-Gene der metagenomischen DNA der unterschiedlichen Proben mittels PCR partiell amplifiziert und mit Hilfe von Sanger- und Pyrosequenzierung sequenziert. Die Auswertung der Sequenzdaten erlaubte die Konstruktion von phylogenetischen Stammbäumen und eine Einteilung der Taxa auf Phylum-Ebene. In den untersuchten Proben konnten Vertreter der Phyla Proteobacteria, Verrucomicrobia, Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria, Cyanobacteria und Actinobacteria nachgewiesen werden. Während im Blinddarm mit über 60 % das Phylum Firmicutes vorherrschte, wurden im Dickdarm als dominante Phyla die Verrucomicrobia (43,5 %) und Firmicutes (37,4 %) nachgewiesen. Die in dieser Arbeit analysierte metagenomische Fosmidgenbank wurde aus DNA aus einer Bodenprobe des Avachinsky-Kraters (Sibirien) konstruiert. Aus 5200 E. coli Fosmidgenbankklonen mit insgesamt 182 Mbp klonierter metagenomischer DNA konnten elf hydrolytisch aktive E. coli-Genbankklone detektiert werden, welche letztlich sechs verschiedene putative (Hemi-)Cellulase-ORFs trugen. Zwei dieser ORFs wurden erfolgreich heterolog in E. coli BL21 exprimiert, und die davon kodierten Enzyme, eine Xylanase (Xyn1015) und eine Lichenase (Bga48), aufgereinigt. Es folgte eine biochemische Charakterisierung der Genprodukte. Xyn1015 zeigte eine maximale hydrolytische Aktivität bei 95 °C, einem pH Wert von 7 und einer NaCl-Konzentration von 1 M im Testansatz. Das Enzym ist außergewöhnlich beständig gegen Hitzeinaktivierung: Nach 24 Stunden Inkubation bei 95 °C konnten noch 50 % der Ausgangsaktivität nachgewiesen werden. Mit Buchenholzxylan als Substrat wurden ein Km-Wert von 2 mg/ml und ein Vmax-Wert von 400 U/mg ermittelt (bei 95 °C, pH 7 und 1 M NaCl im Testansatz). Bga48 zeigte die höchste hydrolytische Aktivität bei 90 °C und einem pH-Wert von 6. Nach fünf Stunden Inkubation bei 75 °C wies das Enzym fast 60 % der Ausgangsaktivität auf. Als Km- bzw. Vmax-Werte wurden 0,24 mg/ml bzw. 200 U/mg ermittelt (Gersten-ß-Glucan, 90 °C, pH 6).