Effekte von Hypericin auf humane renale Karzinomzellen in vitro
Effects of hypericin on human renal carcinoma cells in vitro
by Ann-Christin Busse
Date of Examination:2010-01-22
Date of issue:2010-06-08
Advisor:Dr. Johannes Wessels
Referee:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Hypericin is an agent extracted from Hypericum plants. St. John s wort (Hypericum perforatum, L.) is the most common representative of this genus. Blooms and leaves of Hypericum plants are covered with hypericin-containing glands. Hypericin probably protects the plants from herbivorous insects. This may relate to the photosensitizing properties of this agent. Once diffused into cells, hypericin causes massive cell damage under light exposition due to oxidative stress based on the generation of singlet oxygen. Hypericin seems to be a multikinase inhibitor as well. In this study the effects of hypericin on human renal carcinoma cells were investigated for the first time. Hypericin accumulates in the endoplasmatic reticulum and in the mitochondria but not in the nucleus of renal carcinoma cells. After intracellular uptake hypericin shows an intensive and stable red fluorescence, that is even detectable after 48 hours. Under dark conditions hypericin affect neither metabolic activity nor colony forming ability of the cells. The treatment of renal carcinoma cells with hypericin in combination with illumination leads to a significant decline of metabolic activity and colony forming ability. Futhermore apoptosis is induced in 100% of the cells through this treatment. These phototoxic effects were caused through intracellular formation of reactive oxygen species mainly singlett oxygen that is proved through redoxsensitive fluorescence dye (roGFP). First in this work a significant radiosensitizing effect of hypericin on the very radioresistent renal carcinoma cells could be shown as well. The colony forming ability of renal carcinoma cells after irradiation is significant reduced through hypericin. The metabolic activity of the cells increases after irradiation independent of hypericin treatment. An irradiation with a dose of 2Gy or 4Gy induces apoptosis in only 2,5% or 5% of the cells independent from hypericin treatment. This results suggest that an irradiation in combination with hypericin induces mitotic cell death o f renal carcinoma cells. The radiosensitizing effects of hypericin probably base on inhibition of DNA-repair mechanisms. The results of this work give first advice that the expression and activity of different proteins that are involved in DNA-repair mechanisms, is reduced or slow down through hypericin. That probably leads to a decreased clonogenic survival of the cells after irradiation and that results in an enhanced radiosensitivity of renal carcinoma cells.
Keywords: Renal cell carcinoma; photodynamic therapy; radiosensitizing; DNA-damage repair
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Das Gewöhnliche Johanniskraut (Hypericum perforatum L.) ist eine seit der Antike bekannte Heilpflanze. Einer seiner Inhaltsstoffe, das so genannte Hypericin, ist namensgebend für diese Pflanzengattung und wird in speziellen Drüsen auf Blütenblättern und Blättern produziert. Es dient der Pflanze als Fraßschutz, denn nach Aufnahme führt es in Organismen bei gleichzeitiger Lichtexposition zu massiven Zellschäden entsprechender Regionen. Des Weiteren gibt es aktuell auch erste Hinweise darauf, dass Hypericin ein Multikinasehemmer zu sein scheint. Die photosensibilisierende Wirkung beruht auf intrazellulärem oxidativen Stress, der durch die Bildung von u. a. Singulettsauerstoff ausgelöst wird, während die Multikinase-inhibitorische Wirkung vermutlich auf eine direkte Interaktion des Hypericins mit Proteinen zurückzuführen ist.In dieser Arbeit sollen erstmals die photosensibilisierenden und Multikinase-inhibitorischen Effekte von Hypericin auf Zellen des humanen renalen Karzinoms in vitro untersucht werden. Hypericin akkumuliert in renalen Karzinomzellen im Endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien, jedoch nicht im Zellkern. Nach intrazellulärer Aufnahme zeigt es eine intensive und stabile rote Fluoreszenz, die auch noch nach 48 Stunden nachweisbar bleibt. Unter Lichtausschluß beeinflusst Hypericin weder die metabolische Aktivität noch die Koloniebildungsfähigkeit der Zellen. Eine Hypericinbehandlung renaler Karzinomzellen in Kombination mit einer Beleuchtung, führt schon bei geringen Konzentrationen (1μM) zu einem signifikanten Rückgang der metabolischen Aktivität und Koloniebildungsfähigkeit. Des Weiteren wird in 100% der Zellen eine Apoptose induziert. Diese phototoxischen Wirkungen werden durch oxidativen Stress hervorgerufen. Die intrazelluläre Bildung des oben erwähnten Singulettsauerstoffs spielt dabei die Schlüsselrolle. Letzterer wird hier erstmals mit Hilfe eines redoxsensitiven Fluoreszenzfarbstoffs (roGFP) intrazellulär in lebenden Zellen nachgewiesen. Des Weiteren kann im Rahmen dieser Arb eit erstmals ein signifikanter strahlensensitivierender Effekt von Hypericin auf die sehr strahlenresistenten renalen Karzinomzellen nachgewiesen werden. Es zeigt sich, dass Hypericin die Koloniebildungsfähigkeit renaler Karzinomzellen nach einer Bestrahlung signifikant gegenüber der bestrahlten Kontrolle vermindert. Die metabolische Aktivität der Zellen nimmt unabhängig von der Hypericinbehandlung nach Bestrahlung zu. Eine Apoptoseinduktion in Folge einer Radiatio mit einer Dosis von 2Gy bzw. 4Gy kann lediglich in ca. 2,5% bzw. ca. 5% der Zellen unabhängig von der Hypericinbehandlung nach- gewiesen werden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine Bestrahlung in Kombination mit Hypericin den mitotischen Zelltod renaler Karzinomzellen induziert. Dieser strahlensensitivierende Effekt des Hypericin beruht vermutlich auf der Inhibition von DNA-Reparaturmechanismen. Die Ergebnisse geben erste Hinweise darauf, dass Hypericin die Expression bzw. Aktivität verschiedener an den Reparaturmechanismen beteiligter Proteine verringert bzw. verlangsamt und dadurch möglicherweise zu einem verminderten klonogenen Überleben von renalen Karzinomzellen in Folge von Bestrahlung und damit zu einer Strahlensensitivierung beitragen könnte.
Schlagwörter: Nierenzellkarzinom; Hypericin; Photodynamische Therapie; Strahlensensitivierung; DNA-Reparatur