On the chloride dependence of vesicular glutamate transport
Über die Chloridabhängigkeit des vesikulären Glutamattransports
von Stephan Schenck
Datum der mündl. Prüfung:2009-06-26
Erschienen:2010-06-10
Betreuer:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Gutachter:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Ficner
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Neurons release neurotransmitters in discrete amounts, the quanta. The transmitters are stored in small membrane-bound organelles, the synaptic vesicles, in the vicinity of the plasma membrane at the synaptic terminal. Upon arrival of a signal the content of the vesicles will then be released into the synaptic cleft by means of membrane-fusion to reach the postsynaptic cell. Glutamate is the major excitatory transmitter in the vertebrate brain. Glutamate-filled synaptic vesicles are loaded by the action of the vesicular glutamate transporters (VGLUTs). These secondary active transporters are fueled by a proton-based electrochemical gradient that is generated by the ATP-consuming activity of the vacuolar proton pump (VATPase) that also resides on synaptic vesicles. Biochemical investigations on isolated synaptic vesicles showed that the transport of glutamate depends largely on the membrane potential that is generated by the VATPase but not on a pH-gradient. Furthermore the transport of glutamate depends on low millimolar concentrations of chloride (2-4 mM) and is attenuated by higher concentrations of this small anion. Remarkably, however, the transport is very low when chloride is absent despite the fact that the membrane potential is largest under such conditions. A central aim of this work was to investigate the role of the chloride ion for the glutamate loading mechanism and the acidification of synaptic vesicles in greater detail. For this, synaptic vesicles from mice lacking either the gene for VGLUT1, the major isoform of the VGLUTs, or ClC-3, a putative chloride translocator on synaptic vesicles were investigated with regard to their permeability for chloride ions. Surprisingly, the data clearly favored the idea that VGLUT1 itself is permeable to chloride ions, even in the absence of glutamate, and that ClC-3 was apparently not involved in the movement of chloride into the vesicle lumen. Therefore, the dependence of the glutamate translocation on low millimolar concentrations of chloride is probably lin ked to the permeation of chloride ions through VGLUT1 itself. To further investigate this finding, recombinant VGLUT1 protein of the rat was co-reconstituted with a proton pump into artificial vesicles. A permeation of chloride ions through VGLUT1 could be verified in liposomes. Furthermore, the experimental setup allowed to identify a hitherto unknown transport mechanism of VGLUT1. The data clearly indicated a glutamate/chloride antiport for VGLUT1. Chloride ions which are engulfed during the formation of synaptic vesicles at the plasma membrane would thereby be a factor that define the loading kinetics and the quantal size of glutamate-filled synaptic vesicles.
Keywords: neurotransmitter; glutamate; chloride; synaptic vesicle; liposome; chloride channel; ion channel; VGLUT; ClC-3
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Nervenzellen setzen Neurotransmitter gequantelt frei. Der Neurotransmitter wird dafür in speziellen Organellen, den synaptischen Vesikeln, gespeichert und bei Eintreffen eines Signals in den synaptischen Spalt freigesetzt um die postsynaptische Zelle zu erreichen. Die Aminosäure Glutamat ist der mit Abstand am weitesten verbreitete erregende Neurotransmitter im zentralen Nervensystem der Wirbeltiere. Die Aufnahme von Glutamat in die synaptischen Vesikel wird von den vesikulären Glutamattransportern (VGLUTs) durchgeführt. VGLUTs sind sekundär aktive Transporter, die einen protonenbasierten elektrochemischen Gradienten nutzen der von der vakuolären ATPase (VATPase) bereitgestellt wird. Biochemische Untersuchungen an isolierten Vesikeln zeigten, dass der Transport überwiegend durch das von der VATPase erzeugte Membranpotential angetrieben wird und dass die VGLUTs Chloridkonzentrationen im Bereich von 2-4 mM benötigen um optimal zu transportieren. Eine zentrale Fragestellung dieser Arbeit war, die Rolle des Chlorids für den Glutamattransport zu untersuchen. Dafür wurde der Transport von synaptischen Vesikeln aus Hirnen von Mäusen untersucht, bei denen entweder das VGLUT1-Gen deletiert war oder aber das Gen für einen mutmaßlichen Chloridtransporter auf synaptischen Vesikeln - ClC-3. Hierbei ergaben sich klare Indizien dafür daß Chloridionen nicht durch ClC-3 ins Vesikellumen gelangen, sondern durch VGLUT1 selbst, ein wichtiger Hinweis für das Verständnis der charakeristischen Chloridabhängigkeit des Glutamattransports. Um den Transport hinsichtlich dieses Phänomens genauer zu untersuchen wurde das VGLUT1-Protein der Ratte heterolog exprimiert und aufgereinigt und zusammen mit einer Protonenpumpe in Liposomen rekonstituiert. Dieser Versuchsaufbau ermöglichte, unabhängig vom zellulären Kontext, einen Glutamat/Chlorid Antiport nachzuweisen, eine bislang nur vermutete Funktionsweise der vesikulären Glutamattransporter. Ausserdem konnte die Permeation von Chloridionen, unabhängig von einem Glutamattransport, durch den Tra nsporter selbst gezeigt werden, was die Befunde aus den Untersuchungen der synaptischen Vesikel von VGLUT1-KO Mäusen unterstützte.
Schlagwörter: Neurotransmitter; Glutamat; Chlorid; Synaptisches Vesikel; Liposomen; Chloridkanal; Ionenkanal; VGLUT; ClC-3