Mechanisms of Multivesicular Body Biogenesis and Exosome Release

Abstract

Exosomen sind kleine Vesikel mit einem Durchmesser von ca. 50-100 nm, die von vielen Zellarten sezerniert werden und verschiedene interzelluläre Signalprozesse koordinieren. Nach der Fusion von multivesikulären Endosomen (MVE) mit der Plasmamembran werden die intraluminalen Vesikel (ILV) als Exosomen in den extrazellulären Raum freigesetzt.Welchen molekularen Mechanismen der Sortierung bestimmter Moleküle in die ILV der MVE zugrunde liegen, ist jedoch nicht vollständig geklärt. Um diese Mechanismen besser zu verstehen, wurde der Transport von Proteolipidprotein (PLP) in Oli-neu Zellen, einer Zelllinie von Oligodendrozytenvorläuferzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PLP in eigene Subdomänen der Endosomenmembran tranportiert wird. Der Transport von PLP ins Lumen der Endosomen ist dabei nicht abhängig von der ESCRT-(endosomal sorting complex required for transport)-Maschinerie ab, sondern bedarf der Bildung von Ceramiden. Es konnte eine Anreicherung von Ceramiden in Exosomen nachgewiesen werden; gleichzeitig reduzierte die Hemmung von neutralen Sphingomyelinasen die Freisetzung von Exosomen. Daher wurden GUVs (giant unilamelar vesicles) mit Sphingomyelin hergestellt, in denen zwei unterschiedlichen Phasen vorlagen. Die Hydrolyse von Sphingomyelin an der äußeren Schicht der GUV bewirkte eine Abschnürung intraluminaler Vesikel aus der gelartigen Lipidphase. Es wurde damit ein bisher unbekannter, lipid-abhängiger Weg des Proteintranports in die ILV der MVE für Bildung von Exosomen gefunden.Rab Guanosin triphosphatasen (GTPases) sind Regulatoren des intrazellulären Membransortierung. Um die Wirkung der GAPs (GTPase activating proteins) auf Exosomenfreizetzung zu untersuchen, wurde ein Screen eingesetzt. Die Expression von TBC1D10B, RN-tre, TBC1D10A, TBC1D10C und TBC1D15 reduzierte die Freisetzung von Exosomen in Abhängigkeit von deren katalytischer Aktivität. In einem weiteren biochemischen Screen wurde Rab35 als Kandidatenprotein identifiziert, dessen die GTP-hydrolyse von TBC1D10A-C spezifisch stimuliert wurde. Eine Hemmung der Funktion von Rab35 blockierte die Exsomenfreizetzung, induzierte die Akkumulation von PLP in den Endosomen und erhöhte die Endosomenmobilität an der Plasmamembran. Diese Ergebnisse zeigen eine bisher unbekannte Funktion von Rab35 bei der Regulation von der Docking/Tethering zwischen die MVB und der Plasmamembran. Dass Rab35 zusammen mit nicht-kompaktem Myelin, welches MVE beinhaltet, aufgereinigt werden kann, lässt vermuten, dass die Biogenese von Exosomen auch in der Funktion des zentralen Nervensystems eine Rolle spielt.