p53 activity during adenovirus infection
Die Aktivität des Tumorsuppressors p53 in Adenovirus-infizierten Zellen
by Irina Savelyeva
Date of Examination:2009-10-30
Date of issue:2010-06-24
Advisor:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Adenovirus is a small DNA tumour virus that has been extensively studied, leading to fundamental discoveries in molecular biology of mammalian cells. In particular, adenovirus oncoproteins were shown to inactivate cellular tumour suppressor pathways and this advanced our understanding of molecular mechanisms of cancer formation. p53 is a key tumour suppressor that ensures cellular genomic integrity. Its function is impaired in most human malignancies, and DNA tumour viruses evolved multiple ways to block p53 activity in favour of productive virus infection. Human adenovirus type 5 codes for two oncoproteins, E1B-55 kDa and E4-34 kDa that bind and forward p53 to degradation in proteasomes. Deletion or mutation of E1B-55 kDa leads to a massive accumulation of the p53 protein in infected cells. Based on this fact, an idea of p53-selective replicating oncolytic virus for cancer treatment was proposed. It was assumed that an infection of cancer cells containing mutant or null p53 with E1B-deficient virus should allow unrestricted virus replication and cell lysis. In contrast, normal cells, bearing wild type p53, were expected to block the replication of such virus mutants, since functional p53 should induce cell cycle arrest or apoptosis after infection. This attractive idea was implemented by the creation of an E1B-55 kDa-deleted oncolytic virus, designated ONYX-015. However, in spite of moderate successes in head and neck cancer treatment, ONYX-015 did not become a breakthrough in tumour therapy. As was shown by numerous studies later, E1B-deficient virus replication was independent of the cellular p53 status, though indeed, the virus replicated better in some cancer cells as compared to normal cells. The reason for ONYX-015 failure was understood on the molecular level, when p53 activity was carefully examined after infection. It became clear that, despite massive accumulation of p53, E1B-deficient virus blocked its transcriptional activity and thus prevented cell cycle arrest or apoptosis induction in the infected cells. Therefore, we speculated that, in addition to E1B-55 kDa, adenovirus evolved back up mechanisms of p53 inactivation that were investigated in this study. First of all, we show here that infection with E1B-defective adenovirus mutants induces massive accumulation of p53, without obvious defects in p53 localization, phosphorylation, conformation, and oligomerization. Nonetheless, p53 completely failed to induce its target genes, e. g. p21/CDKN1A, mdm2, and PUMA. Secondly, we found the adenovirus E1A proteins to be responsible for blocking p53 activity in the absence of E1B-55 kDa. Two regions of the E1A gene products independently contributed to p53 suppression. Depending on the E1A conserved region 3 (CR3), E1B-defective virus blocked transcription of p53 target genes, and impaired the ability of the transcription factor Sp1 to bind the p21 promoter. Moreover, the aminoterminal region of E1A, binding the acetyltransferases p300 and CBP, blocked p53 K382 acetylation in infected cells. Mutating either of these E1A regions, in addition to E1B, partially restored p53 activity. We conclude that adenovirus inactivates p53 by at least two E1B-independent mechanisms. Thus, our study provides a mechanistic explanation why the lack of the E1B-55 kDa cannot be expected to result in p53-selective cytotoxicity. The mechanisms of p53 inactivation by E1A, described here, should be taken into account, when attempting to create p53-selective adenovirus for cancer therapy. Our findings may also help to understand the molecular mechanisms of p53 attenuation by other virus species and by virus-independent cancer cells.
Keywords: p53; acetylation; adenovirus; E1A; Sp1
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Adenoviren sind kleine, DNA enthaltende Tumorviren, deren Untersuchung grundlegende Erkenntnisse über molekulare Funktionen von Säugerzellen erbrachte. Eine solche grundlegende Entdeckung ist, dass adenovirale Onkoproteine zelluläre Tumorsuppressor Signalwege inaktivieren können und somit das Tumorwachstum fördern. p53 ist einer der wichtigsten Tumorsuppressoren in der Zelle, welcher die zelluläre genomische Integrität aufrecht erhält. Die p53 Funktion ist in den meisten humanen Tumoren gestört. Dabei haben u.a. DNA Tumorviren verschiedenste Wege entwickelt, um die p53 Aktivität zu blockieren. Sie können somit ihre eigene Vermehrung und die Lyse der Zelle vorantreiben. Zwei Onkoproteine des humanen Adenovirus Typ 5, E1B-55 kDa und E4-34 kDa, können an das p53 Protein binden und dessen Degradation begünstigen. Umgekehrt führt eine Deletion oder Mutation des Onkogens E1B-55 kDa nach Virusinfektion zu einer massiven Akkumulierung des p53 Proteins. Auf diesen Fakten basierend wurde die Idee eines p53-selektiven onkolytischen Virus zur Krebstherapie entwickelt. Es wurde angenommen, dass eine Virusinfektion mit einem funktionsunfähigem E1B Onkoprotein in einer Krebszelle mit mutiertem oder deletiertem p53 eine ungehinderte Vermehrung des Virus und somit schließlich den Zelltod zur Folge hat. Im Gegensatz dazu wurde angenommen, dass gesunde Zellen bzw. Zellen mit einem wildtypischen p53 Protein in der Lage sind die Replikation des E1B-defizienten Virus zu blockieren und über wildtypisches p53 einen Zellteilungsstop und/oder den Zelltod einzuleiten. So würde die Krebszelle selektiv eliminiert werden. Aufgrund dieser Annahmen wurde ein E1B-55 kDa-defizienter onkolytischer Virus mit dem Namen ONYX-015 entwickelt. Jedoch hatte die Anwendung des onkolytischen Virus in der Krebstherapie nur mäßigen Erfolg, sodass ONYX-015 sich nicht in der Klinik durchsetzen konnte. Später konnte durch verschiedene Studien gezeigt werden, dass die Replikation des E1B-55 kDa-defizienten Virus unabhängig von dem p53 Status der Wirtszelle erfolgte. ONYX-015 hemmte trotz einer massiven p53 Akkumulierung die transkriptionelle p53 Aktivität, sodass keine p53 Zielgene angeschaltet und kein Zelltod oder Zellzyklusarrest eingeleitet wurde. Daher vermuteten wir, dass Adenoviren über von E1B-55 kDa unabhängige Mechanismen verfügen, die zu einer p53 Inaktivierung führen. Um diese Vermutung zu untersuchen, infizierten wir Zellen mit verschiedenen E1B-defizienten adenoviralen Mutanten und konnten eine massive p53 Akkumulierung induzieren, ohne offensichtliche Defekte in der p53 Lokalisierung, Phosphorylierung, Konformation und Oligomerisierung. Jedoch wurden keine p53 Zielgene wie p21/CDKN1A, mdm2, oder PUMA induziert und somit die transkriptionelle p53 Aktivität komplett inhibiert. Wir fanden weiterhin, dass das adenovirale E1A Protein die p53 Aktivität in der Abwesenheit von E1B-55kDa hemmt. Dabei inhibieren zwei Regionen des E1A Genprodukts unabhängig voneinander die p53 Aktivität. Weiterhin ist der E1B-defiziente Virus nur in Abhängigkeit von der konservierten Region 3 von E1A (E1A conserved region 3 = CR3) in der Lage, die Transkription von p53 Zielgenen zu inhibieren sowie die Bindung des Transkriptionsfaktor Sp1 an den p21 Promoter zu blocken. Außerdem bindet die aminoterminale Region des E1A Proteins die Acetyltransferasen p300 and CBP und blockiert somit die p53 K382 Acetylierung in infizierten Zellen. Mutationen in diesen E1A Regionen, zusammen mit defizientem E1B 55 kDa, können die Inhibierung der p53 Aktivität teilweise aufheben. Daher schlussfolgern wir, dass Adenoviren über mindestens zwei unabhängige Mechanismen p53 inaktivieren können. Somit hat unsere Studie gezeigt, warum das Fehlen von funktionstüchtigem E1B-55 kDa Protein nicht zu einer p53-selektiven Toxizität führt. Die Mechanismen der p53 Inaktivierung durch das E1A Protein müssen bei der Herstellung eines p53-selektiven onkolytischen Adenovirus für die Krebstherapie mit berücksichtigt werden. Unsere Studie hilft zudem, die generellen molekularen Mechanismen der p53 Inaktivierung besser zu verstehen, auch unabhängig von der onkolytischen Krebstherapie.
Schlagwörter: p53; Adenovirus; Azetylierung; E1A; Sp1