Regulation of septum formation by RHO4 GTPase signalling in Neurospora crassa

Abstract

Zytokinese bezeichnet den Prozess, bei dem eine einzelne Zelle in zwei Tochterzellen geteilt wird, und ist bei Eukaryoten hoch konserviert. Die Rho GTPasen sind in ihrer Funktion als Schlüsselregulatoren zahlreicher zellulärer Prozesse auch wesentlich an der Zellteilung beteiligt. Über die genauen Funktionen der Rho Proteine und deren Regulation in diesem Prozess war zu Beginn meiner Arbeit jedoch wenig bekannt. Die Rho GTPase RHO4 des Euascomyceten Neurospora crassa ist essentiell für die Septierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die N. crassa Knockout-Stammsammlung nach Deletionsmutanten durchsucht, die dieselben Defekte zeigten wie die rho-4 Mutante, d.h. fehlende Septen, dünne Hyphen, abnormes Verzweigungsmuster, langsames Wachstum und zytoplasmatisches Auslaufen. Hierbei wurden die zwei Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) BUD3 und RGF3 identifiziert, die nach ihren Homologen Bud3p und Rgf3p in Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe benannt wurden. Mittels in vitro GEF-Assays wurde gezeigt, dass beide Proteine spezifisch die GDP/GTP-Austauschaktivität von RHO4 stimulieren. Auf gleiche Weise wurde das in Aspergillus nidulans vorkommende BUD3 Homolog AnBud3 als in vitro GDP/GTP-Austauschfaktor von A. nidulans AnRho4 und N. crassa RHO4 identifiziert. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass es sich bei dem RHO4-BUD3 Modul um ein konserviertes Modul innerhalb der Euascomyceten handeln könnte. In vivo Lokalisationsstudien zeigten, dass BUD3 und RGF3 wie die Rho GTPase RHO4 an Septen akkumulieren. Anschließende Untersuchungen zu Lokalisationsabhängigkeiten lassen vermuten, dass die beiden GEFs jeweils zusammen mit RHO4 als zwei voneinander unabhängige Module in der Septierung agieren. Das Modul BUD3-RHO4 scheint hierbei eher an der Festlegung der Septierungsstelle beteiligt zu sein, während RGF3-RHO4 seine Funktion womöglich in dem eigentlichen Septierungsprozess ausübt. Neben den beiden GEFs wurde das Anillin-ähnliche Protein BUD4 als weiteres essentielles Protein für die Septierung in N. crassa identifiziert. Die bud-4 Deletionsmutante wies die oben beschriebenen rho-4 Defekte auf. BUD4 akkumulierte wie BUD3, RGF3 und RHO4 an Septen in vivo. Seine Lokalisation als kortikaler Ring an der zukünftigen Septierungsstelle, noch vor der eigentlichen Septenbildung, war unabhängig von funktionellem BUD3 oder RGF3. Dies legt den Schluss nahe, dass BUD4 oberhalb von beiden RHO4-Modulen als kortikales Markerprotein für die Septierungsstelle agiert. Da zudem BUD3 und BUD4 sowie RHO4 an der Pore vollständig ausgebildeter Septen verblieben, ist es möglich, dass diese Proteine dort zusätzliche Funktionen besitzen.