Kombinatorische Synthese einer Genbibliothek und Analyse ihrer statistischen Struktur

Abstract

Unter Berücksichtigung berechneter Parameter und Verwendung entsprechender Codonmischungen bei der DNA Synthese wurde ein Genrepertoire mit einer bestimmten Populationsstruktur geschaffen. Die partielle codonweise Zufallsmutagenese wurde basierend auf dem Histidin-Bindeprotein-Gens hisJ aus E. Coli nach der Trinukleotidphosphoramidit-Methode durchgeführt. Das Genrepertoire wurde aus Oligonukleotiden über eine primerless PCR und eine anschließende primed PCR assembliert.Die experimentelle Populationsstruktur wurde durch DNA-Sequenzanalyse und statistische Datenanalyse charakterisiert. Die erwarteten Werte wurden mit den experimentellen Ergebnissen verglichen und Rückschlüsse auf das Reaktionsverhalten der Trinukleotide während der chemischen Synthese gemacht.In einem Modellexperiment wurde das Rezeptorenrepertoire als Fusionsprotein mit dem Phagenprotein gpIII auf der Oberfläche von M13 Phagen präsentiert, um als Ausgangspunkt für die Selektion einer Biotin-bindenden Variante zu dienen. Um die Anzahl der Deletionen im Repertoire zu reduzieren, die vermutlich während der DNA Synthese entstanden waren, wurde das randomisierte hisJ-Gen als Fusion mit dem beta-Lactamasegen im Periplasma von E. Coli exprimiert.Auf diese Weise wurden im Ampicillin-Medium nur die Varianten selektiert, die als Fusion mit beta-Lactamase vorlagen und keine Rasterschubmutationen enthielten.