Stammdesign in B. licheniformis
Strain design in B. licheniformis
von Michael Rachinger
Datum der mündl. Prüfung:2010-07-08
Erschienen:2010-07-29
Gutachter:PD Dr. Rolf Daniel
Gutachter:Prof. Dr. em. Gerhard Gottschalk
Dateien
Name:rachinger.pdf
Size:4.44Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Bacillus licheniformis is an organism of great scientific and industrial interest. The analysis of this important bacterium suffers from poor genetic accessibility. Therefore DNA transfer is a central problem for the construction of markerless deletion mutants in B. licheniformis DSM13. Due to the low natural competence of type strain DSM13 conjugative plasmid transfer is the method of choice for introduction of DNA. The pKVM-System was constructed for plasmid-based conjugative DNA-transfer to a variety of Bacillus species and used for strain improvement by introduction of small and large deletions. B. licheniformis H1, a close relative of B. licheniformis DSM13, possesses effective restriction-modification-systems. Therefore an in-vivo methylation system was established to create strain specific methylation patterns. This method was used for introduction of a deletion vector for markerless deletion in B. licheniformis H1. The PBSX-orthologous prophage, an inducible phage of B. licheniformis MW3, was deleted by homologous recombination. The mutant revealed less sensitivity against the phage inducible agent mitomycin C. However, no PBSX-like phage particles were detected. For growth on urea the urease gene cluster from B. licheniformis 9945A was transferred to B. licheniformis MW3, an urease-negative strain. Instability of the insertion was observed and no phenotype was detectable. The genome of B. licheniformis 9945A, a natural competent strain, was sequenced and analysed. Comparison to B. licheniformis DSM13 revealed a smaller amount of potential prophages. Three NRPS gene cluster were detected and similarities to genes of fengycin, bacitracin and lichenysin biosynthesis were observed.
Keywords: Bacillus licheniformis; conjugation; methylation; mutagenesis
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Bacillus licheniformis ist ein Organismus von großem wissenschaftlichem und industriellem Interesse. Aufgrund seiner niedrigen natürlichen Kompetenzraten weist B. licheniformis DSM13 eine schlechte genetische Zugänglichkeit auf. Deswegen müssen bei diesem Organismus andere Transformationstechniken angewendet werden. Insbesondere Konjugation stellte hierfür eine gute Alternative dar. Das pKVM-System konnte ausgehend von E. coli auf verschiedene Bacillus-Spezies übertragen werden. Mit Hilfe dieses Vektorsystems konnten Mutationen in B. licheniformis erzeugt werden. B. licheniformis H1, ein naher Verwandter von B. licheniformis DSM13, besitzt effektive Restriktions-Modifikations-Systeme. Hierfür wurde ein in-vivo-Methylierungssystem etabliert, um das stammspezifische Methylierungsmuster zu erzeugen. Dieses System wurde genutzt, um einen Deletionsvektor für die Erzeugung einer markerfreien Deletion in B. licheniformis H1 zu übertragen. Der PBSX-orthologe Phage, ein induzierbarer Phage in B. licheniformis MW3, wurde durch homologe Rekombination deletiert. Die Mutante zeigte eine erniedrigte Sensitivität gegenüber Mitomycin C, das für die Induktion von lysogenen Phagen eingesetzt wird. Darüber hinaus konnten auch keine Phagenpartikel mehr identifiziert werden. Für ein Wachstum auf Harnstoff wurde der Urease-Gen-Cluster aus B. licheniformis 9945A auf den Urease-negativen Stamm B. licheniformis MW3 übertragen. Neben einer Instabilität der Insertion lieferte diese auch keinen Phänotyp. Das Genom von B. licheniformis 9945A, einem natürlich kompetenten Stamm, wurde sequenziert und analysiert. Im Vergleich zu B. licheniformis DSM13 besitzt dieser Stamm einen reduzierten Satz an potentiellen Prophagen. Drei NRPS-Gencluster mit Ähnlichkeiten zu Genen aus der Fengycin, Bacitracin und Lichenysin-Biosynthese konnten identifiziert werden.
Schlagwörter: Bacillus licheniformis; Konjugation; Methylierung; Mutagenese