Functional characterization of the gene schlappohr (CG7739) during Drosophila development
Funktionelle Charakterisierung des Genes schlappohr (CG7739) während der Entwicklung von Drosophila
von Nils Halbsgut
Datum der mündl. Prüfung:2010-07-05
Erschienen:2010-08-11
Betreuer:Prof. Dr. Andreas Wodarz
Gutachter:Prof. Dr. Andreas Wodarz
Gutachter:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
Dateien
Name:halbsgut.pdf
Size:47.0Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
In this study the role the gene schlappohr (shlp) during development of Drosophila melanogaster (Drosophila) was investigated. shlp encodes a evolutionary highly conserved protein with unknown function. Structure prediction based on the SMART algorithm suggests that Shlp is a single pass transmembrane protein with a classical amino terminal signal peptide followed by a large extracellular domain. Furthermore, a C-terminal only 22 amino acid long intracellular domain is predicted. An alignment of this domain with orthologues from different species reveals high sequence conservation with the very last eight carboxy terminal amino acids even being identical between all animal orthologues. This highly conserved C-terminal domain of Shlp was identified in a yeast-two-hybrid screen with the N-terminus of the polarity protein Bazooka (Baz) as bait. Initially the subcellular localization of Shlp in embryonic neuroblasts (NBs) pointed to a role during the establishment of cortical localization of Baz in NBs, a process which is until now poorly understood. However, further analysis of a shlp mutant that was generated in the course of this study provided evidence that Shlp is not required for cortical recruitment of Baz. Analysis of the shlp mutant also revealed that the cortical localization of Shlp in NBs was an artifact caused by the antibody used in immunofluorescence stainings. shlp mutant flies are viable and fertile but show defects in wing expansion and cuticle tanning that are strikingly similar to defects found in flies with defective Bursicon (Burs) signaling, however with a much lower penetrance. Therefore, we checked for genetic interaction between shlp and rickets (rk), the gene encoding the presumptive Bursicon receptor DLRG2. Despite striking similarities in the observed defects, it was not possible to show that these two genes genetically interact in the same pathway. In unexpanded wings of shlp mutant flies apoptosis of epithelial cells, which is a process that is necessary for proper wing maturation, was severely delayed. In the central nervous system of third instar larvae mutant for shlp the expression pattern of the molting hormone Burs was disturbed with some neurons especially in the thoracic region lacking Burs expression. This suggests that the observed defects in adults might be caused by a reduced number of Burs expressing neurons. Overexpression of a C-terminally eGFP tagged version of Shlp completely inhibited wing expansion, suggesting that this protein has a dominant negative function. Since, TIP, the mammalian homologue of Shlp has a role in immunity, we analyzed if the humoral immune response is affected in shlp mutant flies. However, neither the humoral response to infection with Gram-negative nor the response to Gram-positive bacteria was affected. Additionally, we provide evidence that N-terminally eGFP-tagged Shlp (eGFP-Shlp) is secreted in Drosophila Schneider cells and that Shlp is glycosylated. This is in agreement with the biochemical properties of the mammalian homologue. In order to identify interacting proteins of Shlp, pull down experiments coupled with mass spectrometric analysis of the precipitated proteins were performed.
Keywords: Drosophila; Bursicon; Wing expansion; development; TIP
Weitere Sprachen
In dieser Arbeit wurde das Gen schlappohr (shlp) während der Entwicklung von Drosophila melanogaster (Drosophila) untersucht. shlp kodiert ein evolutionär hoch konserviertes Protein mit bisher unbekannter Funktion. Shlp wurde ursprünglich in einem Hefe-2-Hybrid Screen mit dem hochkonservierten N-Terminus von Bazooka (Baz), dem Drosophila Homolog von Par-3 identifiziert. Baz spielt eine entscheidende Rolle bei der Etablierung der Zellpolarität in Epithelien und neuronalen Stammzellen in Drosophila, den sogenannten Neuroblasten. Für seine Funktion in Neuroblasten muss Baz an den apikalen Kortex binden, jedoch ist noch nicht bekannt, über welchen Mechanismus diese kortikale Rekrutierung abläuft. In unserer Arbeitshypothese hatten wir vermutet, dass Shlp an der apikalen Lokalisierung von Baz beteiligt sein könnte. Durch die Analyse der in dieser Arbeit erzeugten shlp Mutante konnten wir jedoch zeigen, dass Zellpolarität von shlp mutanten Embryonen unverändert zum Wildtyp ist. Daher konnten wir unsere Arbeitshypothese, dass Shlp an der apikalen Lokalisierung von Baz beteiligt ist, nicht bestätigen. shlp Mutanten sind lebensfähig und fertil, die Flügelentfaltung und Kutikulahärtung von shlp mutanten Fliegen ist jedoch fehlerhaft. In nicht entfalteten Flügeln von shlp mutanten Fliegen ist die Apoptose von epithelialen Zellen, ein für die korrekte Flügelentwicklung notwendiger Prozess, stark verzögert. Die an shlp mutanten Fliegen beobachteten Flügelentfaltungsdefekte weisen eine auffällige Ähnlichkeit zu Defekten auf, die bei Mutanten auftreten, die den Bursicon Signalweg betreffen. Bursicon ist ein Hormon, das von holometabolen Insekten nach dem finalen Schlüpfen aus der Puppe sekretiert wird und die Prozesse kontrolliert, die für die finale Entwicklung zum adulten Tier notwendig sind. Wir konnte zeigen, dass das Bursicon-Expressionsmuster von shlp mutanten Larven verändert ist, was nahelegt, dass veränderte Bursicon Level für die in shlp mutanten Fliegen beobachteten Flügelentfaltungsdefekte verantwortlich sein könnten. Das Überexprimieren von einer C-terminal eGFP markierten Version von Shlp verhinderte vollständig die Flügelentfaltung, was darauf hindeutet, dass dieses Protein eine dominant negative Funktion hat. Außerdem konnten wir zeigen, dass eine N-terminal eGFP markierte Version von Shlp von Drosophila Schneider Zellen sekretiert wird und dass Shlp glykosyliert wird. Diese biochemischen Eigenschaften stimmen mit denen des Säugerhomologs von Shlp, TIP, überein.
Schlagwörter: Drosophila; Bursicon; Flügelentfaltung; Entwicklung; TIP