Untersuchung sub-mitochondrialer Proteinverteilungen in unbehandelten und apoptotischen humanen Zellen mittels STED-Mikroskopie

Abstract

Mitochondrien sind ein essentieller Bestandteil eukaryotischer Zellen. Sie besitzen eine komplexe interne Struktur und erfüllen eine Vielzahl verschiedener Aufgaben. Aufgrund ihrer herausragenden Funktion in der Bereitstellung des universellen biologischen Energieäquivalents ATP werden Mitochondrien auch als Kraftwerke der Zelle bezeichnet. Obwohl Mitochondrien zu den am besten untersuchten Organellen gehören, ist bisher wenig über die Verteilung von Proteinen innerhalb von Mitochondrien bekannt. Die lichtmikroskopische Untersuchung sub-mitochondrialer Proteinverteilungen war lange Zeit nicht möglich, da der Durchmesser von Mitochondrien mit 200­400 nm im Bereich der Auflösungsgrenze konventioneller Lichtmikroskope liegt. Die Entwicklung hochauflösender lichtmikroskopischer Techniken wie der STED-Mikroskopie erlaubt es seit kurzer Zeit sub-mitochondriale Proteinverteilungen zu untersuchen, wobei bislang ausschließlich qualitative Studien durchgeführt wurden. In dieser Arbeit wurde die STED-Mikroskopie mit mathematischen Algorithmen kombiniert, um erstmalig quantitative Daten über sub-mitochondriale Proteinverteilungen zu erhalten. Durch die qualitative und quantitative Analyse fluoreszenz-mikroskopischer Daten konnten zwei verschiedene Fragestellungen adressiert werden: (1) Der voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) ist ein Protein der äußeren mitochondrialen Membran, welches für den Transport von Metaboliten wie ATP verantwortlich ist. Im Menschen sind drei verschiedene Isoformen beschrieben. Bis jetzt ist wenig über Unterschiede zwischen den einzelnen hVDAC-Isoformen bekannt. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass die drei hVDAC-Isoformen eine unterschiedliche sub-mitochondriale Lokalisation aufweisen und es konnte eine Aminosäure identifziert werden, die einen Einfluss auf diese Lokalisation hat. Ergebnisse quantitativer Kolokalisationsstudien mit den VDAC-Isoformen untereinander liefern Hinweise auf VDAC-Heterooligomere. Weiterhin konnte durch quantitative STED-Mikroskopie gezeigt werden, dass der Grad der Kolokalisation zwischen hVDAC und seinem putativen Interaktionspartner Hexokinase-I isoform-spezifisch ist. Da zudem ein Anteil der Hexokinase-I mit keiner der drei hVDAC-Isoformen kolokalisiert, deutet dies auf ein komplexeres Zusammenspiel dieser Proteine hin als zuvor angenommen. (2) Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, ist ein zentraler Mechanismus für das Leben aller multizellulären Organismen. Trotz dieser wichtigen Bedeutung ist bis jetzt weder geklärt wie genau Cytochrom c aus den Mitochondrien freigesetzt wird noch ist viel über sub-mitochondriale Proteinverteilungen und mögliche Änderungen während der Apoptose bekannt. Durch quantitative STED-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass keine massiven Änderungen in den Verteilungen von sechs verschiedenen Proteinen während früherer Phasen der Apoptose stattfinden. Vielmehr konnten subtile Änderungen, hin zu homogeneren Proteinverteilungen nachgewiesen werden, die vor der Cytochrom c-Freisetzung stattfinden. Diese Ergebnisse erweitern die Sichtweise auf den apoptotischen Signalweg: Es finden nicht nur, wie zuvor durch andere Studien nachgewiesen, subtile strukturelle Änderungen in den Mitochondrien während der Apoptose statt, sondern vielmehr auch subtile Änderungen in den Verteilungen von mitochondrialen Proteinen, die mit einer Tendenz zur Auflösung von Proteinclustern erklärt werden können. Somit konnten durch die STED-Mikroskopie feine Änderungen in sub-mitochondrialen Proteinverteilungen nachgewiesen werden, die mittels konventioneller Mikroskopie unentdeckt geblieben wären.