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Untersuchungen zu Struktur-Funktionsbeziehungen in der tRNA-ähnlichen Struktur des Rüben-Gelbmosaik-Virus

dc.contributor.advisorSchwienhorst, Andreas PD Dr.de
dc.contributor.authorKlug, Christiande
dc.date.accessioned2012-04-16T14:53:31Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:36Zde
dc.date.issued2004-04-16de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ADBE-4de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-384
dc.description.abstractDas Rübengelbmosaikvirus (TYMV) ist ein (+)-Strang RNA-Virus, der Pflanzen der Familie der Brassicaceae infiziert. Sein Genom von 6318 Nukleotiden (nt) Länge umfaßt eine tRNA-ähnliche Struktur (TLS; 82nt) am 3´-Ende. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Zusammenhang zwischen der Valylierung der tRNA-ähnlichen Struktur des Rüben-Gelbmosaik-Virus und der Replikation, bzw. Amplifikation des Virus. Es wurde der Frage nachgegangen, ob effizient valylierbare TLS-Varianten sich entsprechend effizient in vitro replizieren, bzw. in vivo amplifizieren lassen (und umgekehrt).In einem ersten in vitro Versuch konnte gezeigt werden, daß zwei 3´-Genom-Fragmente des TYMV (RNA) mit den Längen 83nt+2G und 91nt+2G unterschiedlich effizient valylierbar sind. Dabei ist das, mit 83nt fast ausschließlich die virale TLS umfassende, kürzere Molekül etwa 4x effizienter valylierbar.Zusätzlich wurden in vitro (-)-Strang Synthesen mit der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp; Teil der viralen Replikase) durchgeführt, in die 85 Nukleotide-lange TLS-Varianten mit unterschiedlichen Valylierungseigenschaften eingesetzt worden waren. Die TLS-Varianten waren außerdem in Anticodon-Schleife und L1-Schleife verschieden und die Transkriptionseffizienzen wurden in nicht valyliertem und valyliertem Zustand ermittelt. Mit diesen in vitro Experimenten sollte untersucht werden, ob die Länge und Sequenz der beschriebenen Regionen der TLS oder die Valylierungseffizienz (bzw. die Aminosäure am 3´-Ende) Einfluß auf die (-)-Strang Synthese und damit auch auf die Replikation haben. Es wurden in vitro keine signifikanten Unterschiede zwischen den untersuchten Varianten gefunden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den bisher bekannten Eigenschaften der RdRp, wonach diese vor allem ein ungepaartes 3´-ACCA-Ende der TLS benötigt (Deiman et al., 1998; Singh and Dreher, 1998). Auch zugesetztes EF-Tu (E. coli) oder das Antibiotikum Puromycin hatten keinen Einfluß auf die Transkription. EF-Tu scheint also keine Markierungs- ((+)/(-)-Strang) oder Schalterfunktion (Transkription/Translation) für TYMV auszuüben.Mit der Transfektion von Wirtspflanzen (Brassika pekinensis) und Protoplasten (Arabidopsis thaliana) sollte der Frage nachgegangen werden, ob Anticodon- oder L1-Schleife oder Valylierungseffizienz der Varianten unter "naturnäheren" Bedingungen Einfluß auf die Amplifikation von vollständigen Viren nehmen können. Die TLS-Varianten wurden dazu in den Kontext des gesamten TYMV-Genoms gebracht. Die Ergebnisse zeigten übereinstimmend, daß die Valylierungseffizienz der TLS-Varianten wichtig für die Amplifikationsfähigkeit des TYMV zu sein scheint. Geringe Valylierungseffizienz führte zu geringer Amplifikation und umgekehrt. Alle isolierten Revertanten besaßen außerdem eine gegenüber dem Ausgangsmolekül gesteigerte relative Valylierungseffizienz. Im Fall der Variante 8-40 (4UCC), die als relativ effizient valylierbar gemessen wurde und trotzdem nur geringe Amplifikationseffizienz zeigte, war vermutlich die Faltung/Konformation der TLS-RNA in der Weise ungünstig beeinflußt, daß eine nicht bekannte Funktion (eventuell eine Proteinbindung) nicht mehr optimal ausgeführt werden konnte.Abschließend führten die in vitro und in vivo erhaltenen Ergebnisse zu der Annahme, daß die Valylierung der TYMV-TLS fast keinen Einfluß auf die Replikation hat. Vermutlich ist der in vivo beobachtete Einfluß der Aminoacylierungseffizienz auf die Amplifikation insbesondere darauf zurückzuführen, daß nur Varianten, die in ihrer Struktur nicht allzusehr von der des Wildtyps verschieden sind, effizient translatiert werden. Dabei scheint die Struktur der TLS wichtiger als die Valylierung selbst zu sein (siehe auch: Barends et al., 2003). Die Valylierung der TLS könnte also einen wenig wichtigen Nebeneffekt darstellen, es erscheint aber auch denkbar, daß die Aminosäure am 3´-Ende der TLS z.B. bei der Verpackung des Virusgenoms eine Funktion haben könnte.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleUntersuchungen zu Struktur-Funktionsbeziehungen in der tRNA-ähnlichen Struktur des Rüben-Gelbmosaik-Virusde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedAnalysis of structure-function relationships within the tRNA-like structure of the Turnip Yellow Mosaic Virusde
dc.contributor.refereeGatz, Christiane Prof. Dr.de
dc.date.examination2004-01-21de
dc.description.abstractengThe Turnip-Yellow-Mosaic-Virus (TYMV) is a (+)-strand RNA-virus which infects plants of the Brassicaceae family. Its genome of 6318 nucleotides (nt) length contains a tRNA-like structure (TLS; 82nt) at the 3´-end. A possible connection between valylation of the TLS and replication or amplification, respectively, was investigated in this Thesis. Of special interest was the question, if efficiently valylatable TLS-variants are also similar efficient replicating in vitro or amplificating in vivo (or vice versa). In a first in vitro experiment was shown, that two 3´-genome-fragments of TYMV-RNA with length of 83nt+2G and 91nt+2G are differently efficient valylatable. The shorter fragment of 83nt which comprise almost only the viral TLS was four times more efficient valylatable than the other.Additionally in vitro (-)-strand-synthesis was done using viral RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp; part of the viral replicase) and a number of differently valylatable TLS-variants of 85nt length. These TLS-variants were also different in their anticodon- and L1-loop. Their replication efficiencies were taken in valylated and non valylated state. These in vitro experiments were supposed to clear, if length and sequence of the two regions of the TLS or its valylatability (or more exactly the aminoacid) has influence in (-)-strand-synthesis and in this way also in replication. No significant differences were seen between chosen variants. This is in accordance with published data, which says, that the RdRp recognize mainly an unpaired 3´-end of the TLS-RNA (Deiman et al., 1998; Singh and Dreher, 1998). The addition of EF-Tu or Puromycin had also no effect in transkription. This shows, that EF-Tu had no function as marker ((+)/(-)-strand) or switch (transkription/translation) for TYMV.The transfection of host-cells within whole plants (Brassica pekinensis) and protoplasts (Arabidopsis thaliana) should show, if anticodon- or L1-loop or valylation efficiency of the TLS-variants have influence in amplification of the virus in an nature-like environment. The variants were brought into the context of the TYMV-genome for this purpose.Resulting data led to the presumption, that valylation efficiency of variants is important for the amplification of TYMV. Low valylation efficiency occurred with low amplification and vice versa. All isolated revertants showed an higher relative valylation efficiency. The variant 8-40 (4UCC), which was relative efficient valylatable, but nevertheless had a relative low amplification efficiency, maybe suffered a disadvantageous folding/conformation of its TLS-RNA. This could interfere for example with the ability to interact with proteins.Finally, results from in vitro/in vivo experiments led to the conclusion, that valylation of the TLS has very few influence in replication (transcription) of TYMV. in vivo observed influence of aminoacylation efficiency in amplification could be a result of RNA-folding properties of the variants, which determine the extend of their translatability. For that the structure seems more important than the valylation itself (see also: Barends et al., 2003). So the valylation of the TLS could be an unimportant side-effect, but it can be speculated, that it has an unknown function, for example in packaging the virus genome.de
dc.contributor.coRefereeBowien, Botho Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeGradmann, Dietrich Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerTYMVde
dc.subject.gerReplikationde
dc.subject.gertRNA-ähnliche Strukturde
dc.subject.gerValylierungde
dc.subject.ger570 Biowissenschaftende
dc.subject.gerBiologiede
dc.subject.engTYMVde
dc.subject.engreplicationde
dc.subject.engtRNA-like structurede
dc.subject.engvalylationde
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk48.54de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-262-0de
dc.identifier.purlwebdoc-262de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 000: Molekularbiologie, Gentechnologiede
dc.subject.gokfullWJL 100: DNA, RNA, Replikation {Biologie, Genetik}de
dc.subject.gokfullWJD 340: Künstliche Mutationen {Biologie, Genetik}de
dc.identifier.ppn504256882de


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