The function of Nup358 in nucleocytoplasmic transport
Die Funktion von Nup358 im nukleocytoplasmatischen Transport
von Sarah Wälde
Datum der mündl. Prüfung:2010-08-23
Erschienen:2010-10-20
Betreuer:PD Dr. Ralph Kehlenbach
Gutachter:Prof. Dr. Reinhard Lührmann
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Ficner
Dateien
Name:waelde.pdf
Size:17.8Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Nucleocytoplasmic transport occurs through nuclear pore complexes (NPC). Some nucleoporins, components of the NPC, have been suggested to function as initial or terminal binding sites for nuclear transport cargos. In vertebrates, the nucleoporin Nup358/RanBP2 is a major component of the cytoplasmic filaments, and some of its characteristics, like FG-repeats, Ran-binding domains (RanBDs) and the associated RanGAP1, may be directly linked to nuclear transport. However, it had been shown that Nup358 is dispensable for transport of standard cargos into the nucleus. Contrary to these data, a subset of cellular proteins that localize to the nucleus under control conditions accumulated in the cytoplasm upon depletion of Nup358, including the putative tumor suppressor DBC-1 (Hutten, 2007). We demonstrated that depletion of Nup358 by RNA interference (RNAi) leads to reduced import rates of proteins using the importin α/β (Hutten et al., 2008) or transportin pathway (Hutten et al., 2009). These data suggested that Nup358 serves as a general docking site for specific transport complexes. To control the specificity of the observed effect upon Nup358 depletion, an RNAi-resistant mutant of full-length Nup358 was designed. Transfection of exogenous full-length Nup358 could compensate for the loss of endogenous Nup358. We used this tool to delete specific domains of Nup358 in order to identify the responsible regions for nuclear accumulation of Nup358-dependent substrates. Nuclear import does not require pore-associated RanGAP1, as a mutant lacking the RanGAP1 interaction site could compensate for the loss of endogenous Nup358. Clearly, the region, which is sufficient for nuclear import, differs between the importin α/β- and transportin-dependent pathway. An N-terminal fragment, which does not contain any RanBD, could promote nuclear import of DBC-1 and an NLS-reporter, two substrates that use the importin α/β pathway. Furthermore, import of DBC-1 could be inhibited by soluble Nup358 fragments spanning amino acids 1000-1306. Biochemically, we could verify an association between DBC-1 and the N-terminal part of Nup358 which was independent of nuclear transport receptors. By contrast, transportin-dependent cargos require a different region of Nup358 for nuclear import. Altogether, these data suggest that the N-terminal third of Nup358 fulfills the function as an assembly/disassembly platform for cargos of the importin α/β pathway. Loss of Nup358-associated RanGAP1 and the four RanBDs of Nup358 can be overtaken by soluble proteins. Additional regions of Nup358 seem to be required for transportin-dependent import.
Keywords: nuclear pore complex; nucleoporins; Nup358; nucleocytoplasmic transport; importins; DBC-1
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Nukleocytoplasmatischer Transport erfolgt durch in der Kernmembran verankerte Porenkomplexe. Von einigen Nukleoporinen, den Komponenten der Kernporen, wird angenommen, dass sie eine Rolle als Andockstation für Transportkomplexe auf ihrem Weg in bzw. aus dem Kern spielen können. Das Nukleoporin Nup358/RanBP2 ist der Hauptanteil der cytoplasmatischen Filamente in Vertrebratenzellen. Einige seiner Merkmale wie FG-Repeats, vier Bindestellen für die GTPase Ran und assoziiertes RanGAP1 könnten direkt mit Kerntransport in Verbindung gebracht werden. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass der Transport von Standardkernproteinen auch ohne Nup358 erfolgen kann. Im Gegensatz zu dieser Beobachtung konnten wir zeigen, dass sich einige Kernproteine im Cytoplasma von Zellen mit reduziertem Nup358 anhäuften, darunter der putative Tumorsuppressor DBC-1 (Hutten, 2007). Des Weiteren führt die Depletion von Nup358 mittels RNA-Interferenz (RNAi) zu einer verlangsamten Transportrate von Proteinen, die entweder durch den Importin α/β-Komplex (Hutten et al., 2008) oder durch Transportin (Hutten et al., 2009) importiert werden. Somit könnte Nup358 als eine allgemeine Andockstation für spezifische Transportkomplexe fungieren. Um die Spezifität des beobachteten Effekts nach der Ausschaltung des Nukleoporins zu überprüfen, wurde eine siRNA-resistente Mutante von Nup358 in diese Zellen transfiziert, deren Menge an endogenem Nukleoporin reduziert worden war. Anwesenheit von diesem exogenen kompletten Nup358 konnte das Fehlen von endogenem Nup358 kompensieren. Wir nutzten diesen Ansatz, um spezifische Domänen von Nup358 zu eliminieren und somit Rückschlüsse auf die verantwortlichen Regionen des Kerntransports der Nup358-abhängigen Substrate ziehen zu können. So kann auf Poren-assoziiertes RanGAP1 verzichtet werden, da eine Mutante, die RanGAP1 nicht bindet, noch Import vermitteln kann. Zudem unterscheiden sich die Regionen innerhalb von Nup358, die für Transport gebraucht werden, deutlich zwischen dem Importin α/β- und dem Transportinweg. Ein N-terminales Fragment ohne jegliche Bindestelle für Ran konnte dem Kernimport von DBC-1 und eines NLS-Reporterproteins vermitteln, beide sind Importin α/β-Substrate. So konnte Import von DBC-1 durch lösliche Nup358-Fragmente inhibiert werden, die sich über die N-terminale Region der Aminosäuren 1000-1306 erstrecken. Des Weiteren konnten wir biochemisch zeigen, dass diese Interaktion unabhängig von Kerntransportrezeptoren erfolgte. Im Gegensatz hierzu benötigen Transportinkomplexe eine andere Region von Nup358 für den Import. Unsere Daten weisen darauf hin, dass das N-terminale Drittel von Nup358 als Andockstation von Transportkomplexen des Importin α/β-Weges ausreicht. Jedoch scheinen für den Transportin-abhängigen Import weitere Regionen von Nup358 gebraucht zu werden. Der Verlust von Poren-assoziiertem RanGAP1 und den vier Ranbindestellen von Nup358 können durch die entsprechenden löslichen Proteine ausgeglichen werden.
Schlagwörter: Kernporenkomplex; Nukleoporine; Nup358; Nukleocytoplasmatischer Transport; Importine; DBC-1