The function of Nup358 in nucleocytoplasmic transport

Abstract

Nukleocytoplasmatischer Transport erfolgt durch in der Kernmembran verankerte Porenkomplexe. Von einigen Nukleoporinen, den Komponenten der Kernporen, wird angenommen, dass sie eine Rolle als Andockstation für Transportkomplexe auf ihrem Weg in bzw. aus dem Kern spielen können. Das Nukleoporin Nup358/RanBP2 ist der Hauptanteil der cytoplasmatischen Filamente in Vertrebratenzellen. Einige seiner Merkmale wie FG-Repeats, vier Bindestellen für die GTPase Ran und assoziiertes RanGAP1 könnten direkt mit Kerntransport in Verbindung gebracht werden. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass der Transport von Standardkernproteinen auch ohne Nup358 erfolgen kann. Im Gegensatz zu dieser Beobachtung konnten wir zeigen, dass sich einige Kernproteine im Cytoplasma von Zellen mit reduziertem Nup358 anhäuften, darunter der putative Tumorsuppressor DBC-1 (Hutten, 2007). Des Weiteren führt die Depletion von Nup358 mittels RNA-Interferenz (RNAi) zu einer verlangsamten Transportrate von Proteinen, die entweder durch den Importin α/β-Komplex (Hutten et al., 2008) oder durch Transportin (Hutten et al., 2009) importiert werden. Somit könnte Nup358 als eine allgemeine Andockstation für spezifische Transportkomplexe fungieren. Um die Spezifität des beobachteten Effekts nach der Ausschaltung des Nukleoporins zu überprüfen, wurde eine siRNA-resistente Mutante von Nup358 in diese Zellen transfiziert, deren Menge an endogenem Nukleoporin reduziert worden war. Anwesenheit von diesem exogenen kompletten Nup358 konnte das Fehlen von endogenem Nup358 kompensieren. Wir nutzten diesen Ansatz, um spezifische Domänen von Nup358 zu eliminieren und somit Rückschlüsse auf die verantwortlichen Regionen des Kerntransports der Nup358-abhängigen Substrate ziehen zu können. So kann auf Poren-assoziiertes RanGAP1 verzichtet werden, da eine Mutante, die RanGAP1 nicht bindet, noch Import vermitteln kann. Zudem unterscheiden sich die Regionen innerhalb von Nup358, die für Transport gebraucht werden, deutlich zwischen dem Importin α/β- und dem Transportinweg. Ein N-terminales Fragment ohne jegliche Bindestelle für Ran konnte dem Kernimport von DBC-1 und eines NLS-Reporterproteins vermitteln, beide sind Importin α/β-Substrate. So konnte Import von DBC-1 durch lösliche Nup358-Fragmente inhibiert werden, die sich über die N-terminale Region der Aminosäuren 1000-1306 erstrecken. Des Weiteren konnten wir biochemisch zeigen, dass diese Interaktion unabhängig von Kerntransportrezeptoren erfolgte. Im Gegensatz hierzu benötigen Transportinkomplexe eine andere Region von Nup358 für den Import. Unsere Daten weisen darauf hin, dass das N-terminale Drittel von Nup358 als Andockstation von Transportkomplexen des Importin α/β-Weges ausreicht. Jedoch scheinen für den Transportin-abhängigen Import weitere Regionen von Nup358 gebraucht zu werden. Der Verlust von Poren-assoziiertem RanGAP1 und den vier Ranbindestellen von Nup358 können durch die entsprechenden löslichen Proteine ausgeglichen werden.