Untersuchungen zum Fettsäuretransport durch zelluläre und peroxisomale Membranen
Investigation of fatty acid transport across cellular and peroxisomal membranes
by Michael Scharnewski
Date of Examination:2010-01-19
Date of issue:2010-11-12
Advisor:Prof. Dr. Ivo Feußner
Referee:Prof. Dr. Ivo Feußner
Referee:Prof. Dr. Ingo Heilmann
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Name:scharnewski.pdf
Size:2.88Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Despite intensive research and numerous publications the precise mechanism by which free fatty acids cross the plasma membrane is still controversial. Within this work we addressed the question whether acyl-CoA synthetases are involved in lipid transport in Saccharomyces cerevisiae. In our previous studies we could show that the combined deletion of the acyl-CoA synthetases FAA1 and FAA4 in YB332 leads to a fatty acid secretion phenotype which is characterized by a massive export of free fatty acids during the exponential phase and a re-import of free fatty acids during the stationary phase. In order to carry out further transport studies all additional acyl-CoA synthetases were inactivated in the background of the double mutant faa1Δfaa4Δ. Our results could show that transport through the plasma membrane can take place in the absence of any acyl-CoA synthetase activity. The direction of free fatty acid transport is reversible and can be actively regulated by the metabolic state of the cell. Obviously, a specific control mechanism initiates an active export of fatty acids upon a drastic alteration in the composition of the fatty acid pool of the cell. In contrast, shortage of carbon sources, namely a starvation signal, triggers the import of exogenous fatty acids during the stationary phase. In contrast to fatty acid transport across the plasma membrane, transport of fatty acids across the peroxisomal membrane is understood in more detail. In both yeast and plants peroxisomal ABC-transporters with an essential function in the uptake of fatty acids during β-oxidation have been identified. Despite the existence of comparable elements, the mechanism of fatty acid import in plant peroxisomes appears to differ fundamentally from that of S. cerevisiae. In this work, it could be shown, that the ABC-transporter Pat1p-Pat2p from yeast cannot be functionally replaced by the plant ABC-transporter PXA1. Only the combined expression of the plant proteins PXA1 and LACS7 resulted in successful complementation of the double mutant pat1Δfaa2Δ. Therefore, the mechanism of fatty acid import in plant peroxisomes appears to be significantly different from that of S. cerevisiae. In addition, it was possible to obtain insights on the process of fatty acid transport across the peroxisomal membrane and subsequent metabolisation by β-oxidation through the manipulation of the peroxisomal acyl-CoA pool in S. cerevisiae. The combined deletion of the acyl-CoA thioesterase TES1 and the peroxisomal acyl-CoA synthetase FAA2 in YB332 led to a distinct phenotype. This mutant did not exhibit growth in minimal medium in the presence or absence of oleic acid. In addition, a drastic reduction of the cellular acyl-CoA pool was observed. Our data support the hypothesis of a tight interaction of Tes1p and Faa2p, which in combination appear to regulate the ratio of free CoA to acyl-CoA in the peroxisomes. Interestingly, the additional deletion of the peroxisomal ABC-transporter PAT1 could partly suppress the phenotype. Thus, inhibition of the import of acyl-CoA into the peroxisomes can prevent the destabilization of the CoA/acyl-CoA-ratio. Our data indicate for the first time that a degenerated peroxisomal fatty acid metabolism is able to impact the metabolism of the entire cell. Another aspect of fatty acid metabolism was investigated in plants. Very little is known regarding the function of the ABC-transporter PXA1 in Arabidopsis thaliana during the vegetative growth phase. In this work, the phenotype of the pxa1-mutant induced by a phase of prolonged darkness was investigated. An extension of the dark phase resulted in lethality for these plants, while wild-type plants showed no symptoms. Extended dark conditions led to massive damages to the membrane system. Extensive wilting was observed despite sufficient water supply. Our studies showed that under conditions of prolonged darkness, TAG functions as a transient buffer for fatty acids that can finally be released by β-oxidation. The combination of β-oxidation and TAG-synthesis resulted in constant low levels of fatty acids in the wild-type. In the pxa1-mutant, the degradation of fatty acids via β-oxidation is impaired leading to a distinct increase in the concentration of free fatty acids. The detergent-like properties of free fatty acids resulted in severe structural damage of chloroplasts and subsequent cell death. As this phenotype can be suppressed by providing exogenous sucrose, we propose that the release of fatty acids serves as a mechanism to compensate for shortage of energy during extended darkness. It can be concluded that β-oxidation plays an essential role in energy maintenance in adult plants during a phase of prolonged darkness.
Keywords: fatty acid transport; ABC-transporter; acyl-CoA synthetase; acyl-CoA thioesterase
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Der Mechanismus, der den Transport von freien Fettsäuren durch die Plasmamembran vermittelt, ist trotz intensiver Forschung und einer Vielzahl von Publikationen weiterhin unaufgeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit sind wir der Frage nachgegangen, ob Acyl-CoA-Synthetasen am Fettsäuretransport in Saccharomyces cerevisiae beteiligt sind. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass die kombinierte Deletion der Acyl-CoA-Synthetasen FAA1 und FAA4 in YB332 zu einem Fettsäuresekretions-Phänotyp führt, der durch einen massiven Export von freien Fettsäuren während der exponentiellen Phase und einen Re-Import von freien Fettsäuren während der stationären Phase charakterisiert ist. Für die Durchführung weiterer Transportstudien wurden zusätzlich in der Doppelmutante faa1Δfaa4Δ alle anderen bekannten Acyl-CoA-Synthetasen inaktiviert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Transport durch die Plasmamembran ohne jegliche Acyl-CoA-Synthetase-Aktivität stattfinden kann. Die Richtung des Transportes von freien Fettsäuren ist umkehrbar und wird durch den metabolischen Zustand der Zellen aktiv reguliert. Dabei existiert anscheinend ein Kontrollmechanismus, der bei einer drastischen Änderung der Zusammensetzung des Fettsäure-Pools in den Zellen einen aktiven Export der Fettsäuren initiiert. Hingegen wird der Import von exogenen Fettsäuren durch das Fehlen anderer Kohlenstoffquellen, also einem Hungersignal, im Stadium der stationären Phase ausgelöst. Im Gegensatz zum Fettsäuretransport durch die Plasmamembran ist der Transport von Fettsäuren in das peroxisomale Lumen im Detail besser verstanden. In Hefen und Pflanzen wurden peroxisomale ABC-Transporter identifiziert, die eine essentielle Funktion bei der Aufnahme von Fettsäuren im Zuge der β-Oxidation haben. Trotz vergleichbarer Komponenten scheint sich der Mechanismus des Fettsäure-Imports in Peroxisomen der Pflanzen grundlegend von dem in S. cerevisiae zu unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der ABC-Transporter Pat1p-Pat2p aus Hefe nicht durch den pflanzlichen ABC-Transporter PXA1 funktional zu ersetzen ist. Erst die kombinierte Expression der pflanzlichen Proteine PXA1 und LACS7 führte zu einer erfolgreichen Komplementation der Doppelmutante pat1Δfaa2Δ. Der Mechanismus des Fettsäure-Imports in Peroxisomen der Pflanzen scheint sich demnach grundlegend von dem in S. cerevisiae zu unterscheiden. Zusätzliche Erkenntnisse über den Ablauf von Transport der Fettsäuren durch die peroxisomale Membran und anschließender Metabolisierung durch die β-Oxidation haben wir durch die Manipulation des peroxisomalen Acyl-CoA-Pools in S. cerevisiae gewonnen. Die kombinierte Deletion der peroxisomalen Acyl-CoA-Thioesterase TES1 und der peroxisomalen Acyl-CoA-Synthetase FAA2 in YB332 führte zu einem deutlichen Phänotyp. Bei dieser Mutante wurde weder auf Minimalmedium mit Ölsäure noch auf Minimalmedium ohne Ölsäure Wachstum nachgewiesen. Außerdem wurde ein drastisches Absinken der Konzentration des zellulären Acyl-CoA-Pools beobachtet. Unsere Daten belegen somit ein Zusammenwirken von Tes1p und Faa2p, die gemeinsam das Verhältnis von freiem CoA zu Acyl-CoA im Peroxisom zu regulieren scheinen. Interessanterweise konnte durch die zusätzliche Deletion des peroxisomalen ABC-Transporters PAT1 der Phänotyp teilweise aufgehoben werden. Demnach wird eine Destabilisierung des CoA/Acyl-CoA-Verhältnisses durch die Verhinderung des Imports von Acyl-CoA in die Peroxisomen unterbunden. Unsere Daten zeigen somit erstmals, dass ein fehlgeleiteter peroxisomaler Fettsäurestoffwechsel dramatische Auswirkungen auf den Metabolismus der gesamten Zelle erlangen kann. Ein weiterer Aspekt des peroxisomalen Fettsäurestoffwechsels wurde in Pflanzen untersucht. Über die Funktion des ABC-Transporters PXA1 in Arabidopsis thaliana während der vegetativen Wachstumsphase ist wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde ein durch eine verlängerte Dunkelphase induzierter Phänotyp der pxa1-Mutante untersucht. Eine Verlängerung der Dunkelphase führte bei diesen Pflanzen zum vollständigen Absterben, während die Wildtyp-Pflanzen zu diesem Zeitpunkt keine Symptome zeigten. Längere Dunkelphasen führten zu massiven Beschädigungen der Membransysteme. Eine massive Welke setzte trotz ausreichender Wasserversorgung ein. Unsere Studien zeigten, dass TAG unter den Bedingungen einer langanhaltenden Dunkelphase offensichtlich als Depot für Fettsäuren dient, die letztendlich für den Abbau durch die β-Oxidation vorgesehen sind. Die Kombination von β-Oxidation und TAG-Synthese führt dementsprechend zu einem konstant niedrigen Fettsäurespiegel im Wildtyp. In der pxa1-Mutante entfällt der Abbau der Fettsäuren via β-Oxidation und es erfolgt ein deutlicher Anstieg der Konzentration der freien Fettsäuren. Der Detergens-Charakter der freien Fettsäuren führt zu gravierende strukturelle Schäden der Chloroplasten und anschließendem Zelltod. Da dieser Phänotyp durch Zugabe exogener Saccharose unterdrückt werden kann, postulieren wir, dass die Freisetzung von Fettsäuren als Kompensationsmechanismus bei Engpässen der Energieversorgung während langanhaltender Dunkelheit dient. Demnach spielt die β-Oxidation in adulten Pflanzen eine essentielle Rolle für die Aufrechthaltung der Energieversorgung bei einer verlängerten Dunkelphase.
Schlagwörter: Fettsäuretransport; ABC-Transporter; Acyl-CoA-Synthetase; Acyl-CoA-Thioesterase