Über die funktionelle Analyse des murinen peroxisomalen Testis-spezifischen Gen 1 (Pxt1)
On the Functional Analysis of Murine Peroxisomal Testis Specific 1 (Pxt1) Gene
by Karina Paulina Kaczmarek
Date of Examination:2010-01-19
Date of issue:2010-11-26
Advisor:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Format:PDF
Description:Kumulative Dissertation
Abstract
English
Mammalian spermatogenesis is a complex biological process by which diploid spermatogonia differentiate into specialized haploid spermatozoa. Regulation of male gametogenesis involves a highly organized network of genes, which often show germ cell-specific and/or stage-specific expression. Recently, peroxisomes have been found to play an essential role in spermatogenesis. The identification of the mouse peroxisomal testis specific 1 (Pxt1) gene was first reported in 2007 (Grzmil et al., 2007). Initially, Pxt1 was described as a novel, male germ cell-specific gene that encodes a peroxisomal protein. In the present study, insights into the physiological function of PXT1 protein, and thus peroxisomes, in male germ cells are provided. In the first part of the thesis, an interaction partner of PXT1, namely CCDC33, is characterized. We showed that testicular expression of the Ccdc33 gene, similar to the Pxt1, is restricted to male germ cells and starts at the pachytene spermatocyte stage. Furthermore, we found that the Ccdc33 undergoes alternative splicing, giving rise to at least four different transcripts. Based on in silico analysis, the CCDC33 protein is predicted to contain two putative peroxisomal targeting signals type 2 (PTS2) and in further study we demonstrated that one of these two PTS2 motifs is functional and responsible for sorting of CCDC33-dsRED fusion protein to peroxisomes. The co-localization of PXT1 and CCDC33 within vesicle-like structures finally confirmed the peroxisomal localization of CCDC33. In the second part of the thesis, the generation and the analysis of transgenic mice overexpressing PXT1 in the testis are decribed. The infertility of transgenic males due to wide-spread apoptosis of pachytene spermatocytes was demonstrated. In addition, we identified a BH3-like domain, characteristic for pro-apoptotic BCL-2 family members, in the PXT1 protein sequence. By deletion analysis we validated the functionality of the BH3-like domain in transiently transfected HeLa and NIH3T3 cell lines. Furthermore, the interaction of PXT1 with the apoptotic regulator BAT3 was demonstrated and characterized. We found that in transiently transfected mammalian cells, the overexpression of BAT3 could suppress PXT1-induced apoptosis and led to translocation of PXT1 from the cytosol to the nucleus. In addition, PXT1-CCDC33 interaction was validated by different molecular techniques. Moreover, using two PXT1 transgenic mouse lines, we could demonstrate that endogenous 3 UTR of Pxt1 is not involved in the delay of mRNAs translation. Preliminary experiments showed also that apoptosis induced by overexpression of PXT1 in the testes is mediated via caspase 9 independent pathway, thereby indicating that it could be triggered via the extrinsic apoptotic pathway. In conclusion, the data presented here provide interesting insights into the function of PXT1 and peroxisomes in the testis, however, further studies, including analysis of PXT1 knock-out mouse model, will be necessary to determine whether Pxt1 is essential for male fertility. From PXT1 knock-out mice we will also learn about the molecular mechanisms underlying PXT1-induced apoptosis.
Keywords: Pxt1; Bat3; Ccdc33; spermatogenesis; peroxisomes; apoptosis; transgenic mice
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Die Spermatogenese von Säugern ist ein komplexer biologischer Prozess bei dem diploide Spermatogonien in spezialisierte haploide Spermatozoen differenzieren. Die Regulation der männlichen Gametogenese ist verknüpft mit einem hoch organisierten Gen-Netzwerk, welches oft Keimzell-spezifische und/oder Stadien-spezifische Expression zeigt. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Peroxisomen eine essentielle Rolle während der Spermatogenese spielen. Über das murine peroxisomal testis specific 1 (Pxt1) Gen wurde erstmals 2007 berichtet (Grzmil et al., 2007). Zunächst wurde Pxt1 als ein neues, männliches Keimzell-spezifisches Gen beschrieben, welches für ein peroxisomales Protein codiert. In der vorliegenden Arbeit konnten neue Kenntnisse über die physiologischen Funktionen des PXT1 Proteins in der Spermatogenese, und damit auch über Peroxisomen, erhalten werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Interaktionspartner von PXT1, CCDC33, charakterisiert. Die testikuläre Expression des Ccdc33 Gens ist, ähnlich wie Pxt1, auf männliche Keimzellen beschränkt und beginnt in Pachytän-Spermatozyten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es mindestens vier verschiedene Splicing-Transkripte des Ccdc33 Gens gibt. Basierend auf in silico Analysen wurden für das CCDC33 Protein zwei putative peroxisomale Zielsignale des Typs 2 (PTS2) vorausgesagt, von denen in dieser Arbeit eines der beiden PTS2 als funktionell charakterisiert werden konnte. Es ist verantwortlich für die Einsortierung des CCDC33-dsRED Fusionsproteins in die Peroxisomen. Die Kolokalisierung von PXT1 und CCDC33 in Vesikel-ähnlichen Strukturen bestätigt die peroxisomale Lokalisierung von CCDC33. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde über die Generierung und die Analyse von transgenen Mäusen berichtet, die PXT1 im Testis überexprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Infertilität der transgenen Männchen auf eine ausgeprägte Apoptose der Pachytän-Spermatozyten zurück zuführen ist. Ausserdem konnte eine BH3-ähnliche Domäne in der PXT1 Proteinsequenz identifiziert werden, die charakteristisch für proapoptotische BCL-2 Familien-Mitglieder ist. Mit Hilfe von Deletionsanalysen konnte die Funktionalität dieser Domäne in transient transfizierten HeLa und NIH3T3 Zellen bestätigt werden. Zusätzlich konnte eine Interaktion von PXT1 mit dem Apoptose-Regulator BAT3 gezeigt und analysiert werden. In den Säugerzellen konnte die Überexpression von BAT3 die PXT1-induzierte Apoptose unterdrücken und führte zu einer Translokation von PXT1 aus dem Cytosol in den Nukleus. Ausserdem konnte die PXT1-CCDC33 Interaktion mit verschiedenen molekularen Techniken bestätigt werden. Darüber hinaus konnte in zwei PXT1 transgenen Linien gezeigt werden, dass die endogene 3 UTR von Pxt1 nicht in die verzögerte mRNA Translation involviert ist. Vorläufige Experimente zeigten, dass die durch PXT1 Überexpression induzierte Apoptose im Testis durch einen Caspase 9 unabhängigen Signalweg vermittelt wird, möglicherweise durch einen extrinsischen Signalweg. Zusammenfassend liefern die hier erhobenen Daten interessante Einsichten in die Funktion von PXT1 und Peroxisomen im Testis. Dennoch sind weitere Studien, wie zum Beispiel die Analyse von PXT1 knock-out Mäusen, notwendig, um herauszufinden, ob Pxt1 essentiell für die männliche Fertilität ist. Mithilfe der knock-out Mäuse können auch Erkenntnisse über den molekularen Mechanismus der PXT1-induzierten Apoptose gewonnen werden.
Schlagwörter: Pxt1; Bat3; Ccdc33; Spermatogenese; Peroxisomen; Apoptose; transgene Mäuse