Über die funktionelle Analyse des murinen peroxisomalen Testis-spezifischen Gen 1 (Pxt1)

Abstract

Die Spermatogenese von Säugern ist ein komplexer biologischer Prozess bei dem diploide Spermatogonien in spezialisierte haploide Spermatozoen differenzieren. Die Regulation der männlichen Gametogenese ist verknüpft mit einem hoch organisierten Gen-Netzwerk, welches oft Keimzell-spezifische und/oder Stadien-spezifische Expression zeigt. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Peroxisomen eine essentielle Rolle während der Spermatogenese spielen. Über das murine peroxisomal testis specific 1 (Pxt1) Gen wurde erstmals 2007 berichtet (Grzmil et al., 2007). Zunächst wurde Pxt1 als ein neues, männliches Keimzell-spezifisches Gen beschrieben, welches für ein peroxisomales Protein codiert. In der vorliegenden Arbeit konnten neue Kenntnisse über die physiologischen Funktionen des PXT1 Proteins in der Spermatogenese, und damit auch über Peroxisomen, erhalten werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Interaktionspartner von PXT1, CCDC33, charakterisiert. Die testikuläre Expression des Ccdc33 Gens ist, ähnlich wie Pxt1, auf männliche Keimzellen beschränkt und beginnt in Pachytän-Spermatozyten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es mindestens vier verschiedene Splicing-Transkripte des Ccdc33 Gens gibt. Basierend auf in silico Analysen wurden für das CCDC33 Protein zwei putative peroxisomale Zielsignale des Typs 2 (PTS2) vorausgesagt, von denen in dieser Arbeit eines der beiden PTS2 als funktionell charakterisiert werden konnte. Es ist verantwortlich für die Einsortierung des CCDC33-dsRED Fusionsproteins in die Peroxisomen. Die Kolokalisierung von PXT1 und CCDC33 in Vesikel-ähnlichen Strukturen bestätigt die peroxisomale Lokalisierung von CCDC33. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde über die Generierung und die Analyse von transgenen Mäusen berichtet, die PXT1 im Testis überexprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Infertilität der transgenen Männchen auf eine ausgeprägte Apoptose der Pachytän-Spermatozyten zurück zuführen ist. Ausserdem konnte eine BH3-ähnliche Domäne in der PXT1 Proteinsequenz identifiziert werden, die charakteristisch für proapoptotische BCL-2 Familien-Mitglieder ist. Mit Hilfe von Deletionsanalysen konnte die Funktionalität dieser Domäne in transient transfizierten HeLa und NIH3T3 Zellen bestätigt werden. Zusätzlich konnte eine Interaktion von PXT1 mit dem Apoptose-Regulator BAT3 gezeigt und analysiert werden. In den Säugerzellen konnte die Überexpression von BAT3 die PXT1-induzierte Apoptose unterdrücken und führte zu einer Translokation von PXT1 aus dem Cytosol in den Nukleus. Ausserdem konnte die PXT1-CCDC33 Interaktion mit verschiedenen molekularen Techniken bestätigt werden. Darüber hinaus konnte in zwei PXT1 transgenen Linien gezeigt werden, dass die endogene 3 UTR von Pxt1 nicht in die verzögerte mRNA Translation involviert ist. Vorläufige Experimente zeigten, dass die durch PXT1 Überexpression induzierte Apoptose im Testis durch einen Caspase 9 unabhängigen Signalweg vermittelt wird, möglicherweise durch einen extrinsischen Signalweg. Zusammenfassend liefern die hier erhobenen Daten interessante Einsichten in die Funktion von PXT1 und Peroxisomen im Testis. Dennoch sind weitere Studien, wie zum Beispiel die Analyse von PXT1 knock-out Mäusen, notwendig, um herauszufinden, ob Pxt1 essentiell für die männliche Fertilität ist. Mithilfe der knock-out Mäuse können auch Erkenntnisse über den molekularen Mechanismus der PXT1-induzierten Apoptose gewonnen werden.