Pathogenicity of a minimal organism: Role of protein phosphorylation in Mycoplasma pneumoniae

Abstract

Mycoplasma pneumoniae ist ein humanpathogener Organismus, der zu den Mollicutes gehört, einer Gruppe von Bakterien mit stark reduziertem Genom, welche dennoch zum eigenständigen Leben fähig sind. Die verminderte Entwicklung der Mollicutes spiegelt sich in ihren begrenzten regulatorischen Fähigkeiten der Genexpression nieder. Daher könnten posttranslationale Regulationsereignisse wichtig für M. pneumoniae sein, um sich an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Unter den wenigen regulatorischen Proteinen findet man die HPr Kinase (HPrK), die das Phosphocarrier-Protein HPr am Ser-46 phosphoryliert. Dieses Phosphorylierungsereignis ist ein Hauptsignal für die Kohlenstoff-Katabolitrepression in weniger reduzierten Bakterien. Die Funktion von HPr(Ser-P) in M. pneumoniae ist jedoch unbekannt. Für die Proteinphosphatase PrpC konnte eine Beteiligung an der Dephosphorylierung von HPr(Ser-P) gezeigt werden und zusätzlich zu HPrK, kodiert das M. pneumoniae prkC-Gen für eine weitere Serin-/Threonin-Proteinkinase C.Die Untersuchung des kompletten Phosphoproteomes von M. pneumoniae mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Massenspektrometrie ergab die Identifizierung von 63 phosphorylierten Proteinen, darunter viele Enzyme des zentralen Kohlenstoffmetabolismus und Proteine mit entscheidender Bedeutung für die Adhäsion an Wirtszellen. Zusätzlich konnte für 16 Proteine der genaue Phosphorylierungsort bestimmt werden, wobei es sich um 8 Serin- und 8 Threonin-Reste handelte. Ein Phosphoproteom-Vergleich mit anderen Bakterien zeigte jedoch, dass es nur eine sehr schwache Konservierung der Phosphorylierungsorte gibt, selbst dann, wenn die gleichen Proteine in nah verwandten Organismen phosphoryliert werden. Von dieser These gibt es nur eine Ausnahme: Die Phosphorylierung von Phosphozucker-Mutasen an einem Serin-Rest, welcher in allen untersuchten Organismen von den Archaeen über Bakterien bis hin zum Menschen konserviert ist. Für die Phosphozucker-Mutase ManB aus M. pneumoniae konnte gezeigt werden, dass sich das Protein an diesem Serin-Rest autophosphoryliert. Als Schlussfolgerung lässt sich daher festhalten, dass Proteinphosphorylierungen in jedem Organismus sehr spezifisch zu sein scheinen.Für eine genauere Untersuchung des Phosphorylierungsnetzwerkes in M. pneumoniae, wurde das Phosphoproteom des Wildtyp-Stammes und drei isogener Mutanten, in denen entweder eine der beiden Proteinkinasen HPrK und PrkC bzw. die Proteinphosphatase PrpC ausgeschaltet ist, miteinander verglichen. Die Analyse des Phosphorylierungsprofiles der hprK-Mutante zeigte, dass nur HPr von HPrK phosphoryliert wird. Im Gegensatz dazu waren sechs Proteine, einschließlich dem Hauptadhesin P1 und den zwei Adhärenz-Proteinen HMW1 und HMW3, von einer Inaktivierung von PrkC beeinflusst. Des Weiteren kam es bei einem Verlust von PrpC, der antagonistisch zu PrkC wirkenden Phosphatase, zu einer stärkeren Phosphorylierung der gleichen Zielproteine. Bei der phänotypischen Untersuchung der prkC-Mutante konnte ein nicht-adhärentes Wachstum festgestellt werden, welches mit einem Verlust der Zytotoxizität gegenüber HeLa-Zellen einherging. Daraus lässt sich schließen, dass PrkC-vermittelte posttranslationale Modifikationen von Adhärenz-Proteinen essentiell für die Zelladhäsion und die Virulenz von M. pneumoniae sind.Bei der Analyse des Phosphoproteomes zeigte sich, dass viele glykolytische Enzyme phosphoryliert werden. In M. pneumoniae dient die Glykolyse als Hauptquelle für die Erzeugung von Energie mittels Substratkettenphosphorylierung. Mit Hilfe eines bakteriellen Zwei-Hybrid-Ansatzes konnte die Enolase als das zentrale glykolytische Enzym in M. pneumoniae identifiziert werden, da sie in der Lage ist, mit allen anderen Proteinen der Glykolyse direkt zu interagieren. Des Weiteren führen die meisten glykolytischen Enzyme Selbstinteraktionen aus. Die Ergebnisse verdeutlichen daher, dass sogar in einem Minimalorganismus die Glykolyse in einer sehr geordneten Art und Weise abläuft.Der natürliche Lebensraum von M. pneumoniae sind die Lungenoberflächen, welche hauptsächlich aus Phosphatidylcholin bestehen. Dieses Phospholipid kann entweder direkt in die Zellenmembran eingebaut werden oder als Vorläufer für viele zelluläre Prozesse dienen. M. pneumoniae besitzt mit MPN420 (GlpQ) und MPN566 zwei potentielle Glycerophosphodiesterasen, die in der Lage sind, deacetylierte Phospholipide zu Glycerol-3-Phosphat und Cholin zu spalten. Im Weiteren wird das gebildete Glycerol-3-Phosphat durch Enzyme des Glycerol-Metabolismus abgebaut, wobei Wasserstoffperoxid entsteht, welches entscheidend für die Zytotoxizität von M. pneumoniae ist. Biochemische Analysen zeigten, dass GlpQ eine Glycerophosphodiesterase-Aktivität besitzt, während MPN566 in vitro nicht enzymatisch aktiv ist. Die Untersuchung von Mutanten, bei denen jeweils eine der beiden Glycerophosphodiesterasen ausgeschaltet ist, ergab, dass eine Inaktivierung von mpn566 keine phänotypischen Auswirkungen zur Folge hat. Im Gegensatz dazu wies die glpQ-Mutante einen Wachstumsdefekt in Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle auf. Außerdem kam es durch die Inaktivierung von GlpQ zu einem Ausbleiben der Wasserstoffperoxid-Bildung in Anwesenheit von deacetylierten Phospholipiden und einem Verlust der Zytotoxizität gegenüber HeLa-Zellen. Diese Beobachtungen zeigen, dass GlpQ wichtig für die Pathogenität von M. pneumoniae ist, aber auch für weitere Funktionen in der Zelle. In der Tat deuten vergleichende Proteom- und Transkriptom-Analysen vom Wiltyp-Stamm und der glpQ-Mutante auf eine GlpQ-abhängige Transkriptionsregulation hin, wodurch die Proteinmengen des Glycerol-Facilitators, der Untereinheit eines Metallionen-ABC-Transporters und von drei Lipoproteinen beeinflusst werden. Interessanterweise findet man bei allen GlpQ-abhängig regulierten Genen eine konservierte regulatorische Region in 5 -Richtung oberhalb des kodierenden Bereichs. Bis auf weiteres lässt sich jedoch nur spekulieren, ob GlpQ direkt oder ein Trans kriptionsfaktor, der von GlpQ gesteuert wird, für diese Regulation verantwortlich ist.