Molecular Mechanisms of Serotonergic Signaling: Role in Neuronal Outgrowth and Receptor Oligomerization
Molekulare Mechanismen des serotonergen Systems: Rolle bei neuronalem Wachstum und Rezeptoroligomerisierung
by Fritz Kobe
Date of Examination:2010-04-30
Date of issue:2010-12-21
Advisor:Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin
Referee:Prof. Dr. Michael Hörner
Referee:Prof. Dr. Erwin Neher
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Role of 5-HT7/G12 signaling in morpho- and synaptogenesis. The neurotransmitter serotonin (5-hydroxytryptamine or 5-HT) modulates different aspects of early neuronal differentiation, including neurite outgrowth and synaptogenesis, before it acts as a neurotransmitter. Here we report that activation of the 5-HT7 serotonin receptor promotes dendritic branching, formation of the new synapses as well as spontaneous synaptic activity. The morphological effects obtained upon stimulation of the 5-HT7 receptor were mediated solely by the G12 protein, demonstrating the critical role of 5-HT7/G12 signaling for formation of dendritic filopodia and synaptogenesis. Analysis of organotypic preparation from the hippocampus of juvenile mice demonstrate that 5-HT7R/G12 signaling potentiates formation of dendritic spines, increases the basal neuronal excitability and leads to robust changes in long-term potentiation (LTP). We also found that the expression of both 5-HT7 receptor and G12 protein was significantly reduced during development. Accordingly the effects of 5- HT7/G12 signaling in adult mice were abolished. Thus, regulated expression of both 5-HT7 receptor and G12 protein may represent a molecular mechanisms by which serotonin specifically modulate the formation of basal neuronal connections during the early postnatal development. Oligomerization of 5-HT1A receptor. In the present study we analyzed the oligomerization state of the serotonin 5-HT1A receptor and studied oligomerization dynamics in living cells. We also investigated the role of receptor palmitoylation in this process. Biochemical analysis performed in neuroblastoma N1E-115 cells demonstrated that both palmitoylated and non palmitoylated 5-HT1A receptors form homo-oligomers and that the prevalent receptor species at the plasma membrane are dimers. A combination of an acceptor-photobleaching FRET approach with fluorescence lifetime measurements verified the interaction of CFP- and YFP-labeled wild-type as well as acylation-deficient 5-HT1A receptors at the plasma membrane of living cells. Using a novel FRET technique based on the spectral analysis we also confirmed the specific nature of receptor oligomerization. The analysis of oligomerization dynamics revealed that apparent FRET efficiency measured for wild-type oligomers significantly decreased in response to agonist stimulation, and our combined results suggest that this decrease was mediated by accumulation of FRET-negative complexes rather than by dissociation of oligomers to monomers. In contrast, the agonist mediated decrease of FRET signal was completely abolished in oligomers composed by non-palmitoylated receptor mutants, demonstrating the importance of palmitoylation in modulation of the structure of oligomers.
Keywords: serotonin; 5-HT7 receptor; 5-HT1A receptor; G12 Protein; Synaptogenesis; Oligomerization; FRET; palmitoylation
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Rolle des 5-HT7/G12 Signalwegs bei der Morpho- und Synaptogenese. Der Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin oder 5-HT) moduliert, zusätzlich zu seiner Funktion als Neurotransmitter, verschiedene Aspekte der frühen neuronalen Differenzierung, einschließlich des Neuritenwachstums und der Synaptogenese. Diese Arbeit zeigt, dass die Aktivierung des 5-HT7 Serotoninrezeptors dendritische Verzweigungen, die Formation neuer Synapsen und die spontane synaptische Aktivität fördert. Die durch die Stimulation des 5-HT7 Rezeptors ausgelösten morphologischen Veränderungen wurden ausschliesslich durch das G12 Protein vermittelt, was die wichtige Rolle des 5-HT7/G12 Signalswegs für die Formation von dendritischen Filopodien und der Synaptogenese unterstreicht. Die Analyse von organotypischen Präparationen des Hippokampus juveniler Mäuse zeigte, dass die Aktivierung des 5-HT7/G12 Signalwegs die Formation von dendritischen Spines und die basale neuronale Erregbarkeit erhöhen und zu robusten Veränderungen der Long Term Potentiation führen. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass die Expression des 5-HT7 Rezeptors sowie des G12 Proteins während der Entwicklung signifikant abnahm. Demzufolge waren die durch den 5-HT7/G12 Signalwegs ausgelösten Veränderungen in adulten Mäusen aufgehoben. Somit kann die regulierte Expression des 5-HT7 Rezeptors und des G12 Proteins einen molekularen Mechanismus darstellen bei dem Serotonin die Formation grundlegender neuronaler Verbindungen während der frühen postnatalen Entwicklung spezifisch moduliert. Oligomerisation des 5-HT1A Rezeptors. Die vorliegende Studie analysiert den Oligomerisationszustand des 5-HT1A Rezeptors und untersucht die Oligomerisationsdynamik in lebenden Zellen. Gleichzeitig wurde der Einfluss der Rezeptorpalmitoylierung auf diesen Prozess untersucht. Biochemische Analysen die in Neuroblastomazellen, N1E-115, durchgeführt wurden zeigten, dass beide, palmitoylierte und nicht-palmitoylierte 5-HT1A Rezeptoren, Homo-Oligomere bilden und, dass die vorherrschende Rezeptorspezies an der Plasmamembran Dimere sind. Eine Kombination von Akzeptor-Photobleaching FRET mit Fluoreszens Lifetime Messungen verifizierte die Interaktion von CFP- und YFP gelabelten Wildtyp sowie Acylation-defizienten 5-HT1A Rezeptoren an der Plasmamembran lebender Zellen. Durch die Nutzung einer neuen FRET Technik, die auf spektraler Analyse beruht, konnte die spezifische Natur der Rezeptoroligomerisierung bestätigt werden. Die Analyse der Oligomerisationdynamik zeigte, dass die apparente FRET Effizienz die bei Wildtyp Oligomeren in Reaktion auf Agoniststimulation gemessen wurde, signifikant erniedrigt war. Die kombinierten Ergebnisse lassen darauf schliessen, dass diese Erniedrigung durch Akkumulation von FRET negativen Komplexen und nicht durch die Dissoziation von Oligomeren zu Monomeren vermittelt werden. Im Kontrast dazu, war der Agonist vermittelte Rückgang des FRET Signals bei Oligomeren aus nicht-palmitoylierten Rezeptor Mutatanten komplett aufgehoben, was auf die Bedeutung der Palmitoylierung bei der Modulation der Struktur der Oligomere hinweist.
Schlagwörter: Serotonin; 5-HT7 Rezeptor; 5-HT1A Rezeptor; G12 Protein; Synaptogenese; Oligomerisierung; Palmitoylierung; FRET