The regulation of hypoxia-responsive gene expression by hydroxyl radicals and intracellular calcium

Abstract

Die heterogene Sauerstoffverteilung im Gewebe benötigt ein O2-sensing-System" und einen untergeordneten Signaltransduktionweg", welcher die Durchführung einer anpassungsfähigen Antwort erlaubt. Es wird angenommen, dass Hydroxylradikale (OH·), welche in der Fenton-Reaktion entstehen als Boten" am O2-Signaltransduktionweg" beteiligt sing. Die Fenton-Reaktion konnte durch den Gebrauch von nicht-fluoreszierendem Dihydrorhodamin (DHR) lokalisiert werden, das durch die in der Fenton Reaktion entstehenden OH· zum fluoreszierenden Rhodamin (RH) umgesetzt wird. Diese Fluoreszenz kann dann zusammen mit der Fluoreszenz von Fluoreszenzprotein-Genkonstrukten, die spezifisch im Mitochondrium, endoplasmatischen Retikulum (ER), Golgi Apparat, Peroxisomen und Lysosomen exprimiert werden, durch 2 Photonen konfokale Laserscan Mikroskopie (2 PCLSM) colokalisiert werden. Durch diese 2 PCLSM und dreidimensionale Rekonstruktion der Zellen konnte gezeigt werden, dass die Erzeugung der OH· am endoplasmatischem Retikulum lokalisiert und strikt pO2-abhängig ist. Weiterhin vermindert das Wegfangen der OH· durch DHR die Aktivität der HIF-Prolyl-Hydroxylase (PHD) und die Interaktion des von Hippel-Lindau Proteins (VHL), was somit zu einer vermehrten HIF-1a Proteinexpression, Kerntranslokation, Transaktivierung und Steigerung der Expression der HIF-1a Zielgene führt. Verschiedene Agentien darunter Tunicamycin, Brefeldin A und Thapsigargin wurden benutzt, um das ER in Stress zu versetzen. Dabei wurde gefunden, dass sowohl Tunicamycin als auch Brefeldin A die Hypoxie-induzierte HIF-1a Aktivierung aufheben. Thapsigargin, ein Hemmer der Ca2+-ATPase, hingegen führt zu einer Stüferung der HIF-1a Proteinexpression unter Normoxie in HepG2 Zellen, was daraufhin deutet, dass intrazelluläres Calcium am O2-Signaltransduktionweg" beteiligt ist. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit verschiedene Reagentien, die zu einem Anstieg oder einer Abnahme des intrazellulären Ca2+-Spiegels führen, die HIF-1a Proteinexpression beeinflussen. Dabei bedingte die Calcium Ionophore A23187 eine Stimulation der HIF-1a mRNA Expression, während der intracelluläre Calcium Chelator BAPTA-AM HIF-1a nur transient durch Protein-Stabilisierung induziert. Zusammenfassend regulieren beide, A23187 und BAPTA-AM, die Expression des HIF-1 Zielgens PAI-1 hoch.