Räumliche und zeitliche Untersuchungen zum Teilungsapparat der äußeren Mitochondrienmembran mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie
Spatial and temporal studies of the mitochondrial outer membran fission machinery using fluorescence microscopy with super resolution
by Nadia Martini
Date of Examination:2004-01-22
Date of issue:2004-03-26
Advisor:Prof. Dr. Stefan Hell
Referee:Prof. Dr. Ulrich Ehlers
Referee:Prof. Dr. Hans-Ulrich Mösch
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-424
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Description:Dissertation
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Abstract
English
In the baker´s yeast Saccharomyces cerevisiae the mitochondrial compartment forms an extended tubular network. The maintenance of this reticulate structure has been proposed to require a balanced frequence of mitochondrial fusion an fission events. In this study a detailed analysis of mitochondrial dynamics resolved in time and space, focusing on wildtype cells and Δfis1 and Δdnm1 mutant cells, is presented. Fis1p and Dnm1p have been proposed to mediate fission of the outer mitochondrial membrane. Mitochondria of all stains were labelled with GFP ("green fluorescent protein") targeted to the matrix.Confocal microscopy following glucose repression reveals, that cells lacking Fis1p are able to modify morphology of their mitochondria from highly branched to simple structures as well as wildtype cells. The frequencies of matrix separation and fusion events decrease in both. Double-labelling experiments demonstrated, that some of these observed matrix separations in Δfis1 mutants are due to genuine tubule fissions. Moreover it has been shown, that in these mutants matrix constrictions without fission of the outer membrane take place.In Δdnm1 mutants numerous matrix constrictions but no tubule fissions have been observed. Dnm1p is apparently essential for complete mitochondrial tubule fission but not for matrix constriction.Moreover the new method of MMM-4Pi microscopy has been applied to get further information about the proteins which are involved in mitochondrial dynamics. Comparison with conventional confocal microscopes reveals a 3-5 fold better axial resolution of the MMM-4Pi microscope. Images of Δfis1, Δdnm1 and Δmdv1 mitochondria and several double mutants with axial super resolution allow new insight into the morphology of the mitochondrial network.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae; glucose repression; outer mitochondrial membran; MMM-4Pi; tubular diameter
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Die Mitochondrien der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bilden ein ausgedehntes tubuläres Netzwerk. Zur Aufrechterhaltung der Netzstruktur finden fortlaufend Tubulusteilungen und Fusionen statt. In der vorliegenden Arbeit wird eine detaillierte Analyse dieser mitochondrialen Dynamiken in Raum und Zeit vorgestellt. Dazu wurden neben Wildtypmitochondrien u.a. die Mitochondrien der Deletionsmutanten Δfis1 und Δdnm1 untersucht. Fis1p und Dnm1p werden eine Rolle bei der Teilung der äußeren Mitochondrienmembran zugeschrieben. Die mitochondriale Matrix sämtlicher verwendeter Zellen war mit GFP ("green fluorescent protein") markiert.In Langzeitaufnahmen konnte gezeigt werden, dass unter Glucoserepression in Δfis1-Mutanten ebenso wie in Wildtypzellen aus hochverzweigten Mitochondrien einfache überwiegend tubuläre Strukturen entstehen. In beiden Fällen sinkt dabei die Frequenz von Matrixseparationen und Fusionen. Doppelmarkierungen in Δfis1-Mitochondrien beweisen zweifelsfrei, dass einige der beobachteten Matrixseparationen auf Tubulusteilungen zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in diesen Mutanten Matrixkonstriktionen ohne Beteiligungen der äußeren Membran stattfinden können.In Δdnm1-Mutanten konnten zahlreiche Matrixkonstriktionen, aber keine Tubulusteilungen beobachtet werden. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass die GTPase Dnm1p essentiell für die Tubulusteilung ist, Matrixkonstriktionen aber auch ohne dieses Protein ablaufen können.Weiterhin wurde in dieser Arbeit das neue Verfahren der MMM-4Pi-Mikroskopie angewendet, um weitere Informationen über die an der mitochondrialen Dynamik beteiligten Proteine zu gewinnen. In axialer Richtung ist die Auflösung dieses Mikroskops 3-5 mal höher als bei einem konventionellen konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Anhand von hochauflösenden Aufnahmen der Mitochondrien von Δfis1-, Δdnm1- und Δmdv1-Zellen und zahlreicher Doppeldeletionsmutanten werden in dieser Arbeit neue Einblicke in die Morphologie des mitochondrialen Netzwerks gegeben.
Schlagwörter: Saccharomyces cerevisiae; Glucoserepression; äußere Mitochondrienmembran; MMM-4Pi; Tubulusdurchmesser; 570 Biowissenschaften; Biologie
