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Charakterisierung von Leupaxin und seiner Interaktionspartner in Karzinomzellen

Charakterisation of Leupaxin and its interaction partners in carcinoma cells

by Sandra Gräfin von Hardenberg
Doctoral thesis
Date of Examination:2010-09-29
Date of issue:2011-02-23
Advisor:Dr. Silke Kaulfuß
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
Referee:Prof. Dr. Jürgen Wienands
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-430

 

 

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Name:von_hardenberg.pdf
Size:36.4Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Leupaxin (LPXN) is identified as a protein enhancing the growth of existing TRAMP-tumours and metastasis. Various pathways give evidence of this effect. The overexpression of LPXN in Prostate cancer (PCa) cells increases both the migratory and the invasive capability of the cells. Studies of the Cell adhesion molecule p120CTN show that the overexpression of LPXN results in downregulation of p120CTN expression. Furthermore the PCa-celllines PC-3 and DU 145 show that downregulation of p120CTN-expression results in an increased migratory and invasive capability in comparison to control cells. In contrast the outcome of downregulation of LPXN expression is a decreased migratory and invasive ability of the cells. Finally, the simultaneous downregulation of both, LPXN- and p120CTN-expression leads to the neutralisation of the effects. Knockdown of LPXN-expression results in the localisation of β-Catenin at the cell membrane and the reduction of the expression of the MMP-7-protein. On the other hand knockdown of p120CTN-expression causes a localisation of β-Catenin in the nucleus and an increased MMP-7-expression. The concurrent knockdown of LPXN- and p120CTN-expression again leads to the neutralisation of the effects. An antiboby-array shows that the kinases TAK1 and Yes are downregulated after LPXN knockdown. Depending on the intensity of the LPXN-expression the status of phosphorylation of the kinase JNK, which stands downstream of TAK1, varies. The target genes Maspin and Presinilin1 of the TAK1-JNK-ATF-2-pathway show a significantly downregulated expression in PCa-Cells with LPXN knockdown. LPXN interacts with the actin binding protein Caldesmon. In PC-3-cells Caldesmon localises at the F-Actin filaments and colocalises with LPXN at the focal adhesion sites. Downregulation of Caldesmon expression in PC-3- and DU 145-cells resultes in an elevated migratory and invasive capability. The expression of LPXN has no effect on the expression of caldesmon but on its status of phosphorylation. A decreased expression of LP XN leads to a decreased phosphorylation of Caldesmon. This results in a reduction of the migratory ability of the cells. Furthermore in PC-3-, DU 145- and murine LPXN/TRAMP primary cells a downregulated LPXN-expression leads to modified adhesion and modified spreading of the cells in comparison to the controls. In this context, the activity of the small RhoGTPases RhoA and Rac1 in PC-3-cells with downregulated LPXN-expression has been analysed. Knockdown of LPXN-expression leads to decreased RhoA- and increased Rac1-expression.
Keywords: Leupaxin; Prostatakarzinom; TRAMP; verstärkte Migration und Invasivität; p120CTN; β-Catenin; TAK1; Yes; Caldesmon; RhoA; Rac

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Leupaxin (LPXN) wird im Rahmen dieser Arbeit als ein Protein identifiziert, welches das Wachstum von bestehenden TRAMP-Tumoren sowie von Fernmetastasen beschleunigt. Verschiedene Signalwege, die sich als LPXN-abhängig herausgestellt haben, geben Erklärungen für diese verstärkte Progression. Durch die Überexpression von LPXN in Prostatakarzinomzellen (PCa) ist sowohl die Migrations- als auch die Invasionsfähigkeit der Zellen erhöht. Untersuchungen des Zelladhäsionsmoleküls p120CTN in den PCa-Zelllinien PC-3 und DU 145 zeigen, dass die Überexpression von LPXN in einer reduzierten Expression von p120CTN resultiert. Außerdem weisen diese Zelllinien nach Herunterregulierung der p120CTN-Expression eine erhöhte Migrations- und Invasionsfähigkeit im Vergleich zu Kontrollzellen auf. Eine Herunterregulierung der LPXN-Expression resultiert hingegen in einer verminderten Migrations- und Invasionsfähigkeit der Zellen. Die simultane Herunterregulierung der LPXN- und p120CTN-Expression schließlich resultiert in einer Aufhebung der Einzel-Effekte. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von β-Catenin und zur Expression des β-Catenin-Zielgens MMP-7 in PC-3-Zellen zeigen, dass der knockdown der LPXN-Expression in einer Lokalisation von β-Catenin an der Zellmembran resultiert sowie in einer Reduktion der MMP-7-Expression, während der knockdown der p120CTN-Expression eine Lokalisation von β-Catenin im Kern und eine erhöhte MMP-7-Expression zur Folge hat. Der simultane knockdown der LPXN- und p120CTN-Expression ergibt wiederum eine Aufhebung der Einzel-Effekte. Mit Hilfe eines Antikörper-Arrays sind die Kinasen TAK1 und Yes als herunterregulierte Gene nach LPXN-knockdown identifiziert worden. Abhängig von der Stärke der LPXN-Expression nimmt in PC-3-Zellen auch der Phosphorylierungsstatus der downstream von TAK1 stehenden Kinase JNK zu. Die TAK1-JNK-ATF-2-Zielgene Maspin und Presenilin1 zeigen in PCa-Zellen mit herunterregulierter LPXN-Expression eine signifikant herunterregulierte Expression. LPXN interagiert mit dem Aktin bindenden Protein Caldesmon. In PC-3-Zellen lokalisiert Caldesmon an den F-Aktin-Fasern sowie kolokalisiert mit LPXN an den focal adhesion sites. Die Herunterregulierung der Caldesmon-Expression in PC-3- und DU 145-Zellen resultiert in einer erhöhten Migrations- und Invasionsfähigkeit. Die LPXN-Expression hat keinen Effekt auf die Expression von Caldesmon, beeinflusst aber dessen Phosphorylierungsstatus. Bei einer verminderten LPXN-Expression zeigt sich eine verringerte Phosphorylierung von Caldesmon, was zu einer Reduktion der Migrationsfähigkeit der PCa-Zellen führt. Weiterhin führt eine verminderte LPXN-Expression in PC-3- und DU 145-Zellen sowie den murinen LPXN/TRAMP-Primärzellen im Vergleich zu Kontrollzellen zu einer veränderten Adhäsionsfähigkeit sowie Ausbreitung der Zellen. Da bei der für die Adhärenz und Ausbreitung der Zellen notwendigen Umstrukturierung des Zytoskeletts vor allem die Familie der kleinen Rho-GTPasen eine Rolle spielen, wurden die Aktivitäten von RhoA und Rac1 in PC-3-Zellen mit verminderter LPXN-Expression untersucht: Eine verminderte LPXN-Expression führt zu verringerter RhoA- und verstärkter Rac1-Aktivität.
Schlagwörter: Leupaxin; Prostate cancer; TRAMP; increased migratory and invasive behaviour; p120CTN; β-Catenin; TAK1; Yes; Caldesmon; RhoA; Rac1
 

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