Rho GTPases and their regulators in cell polarity of the filamentous ascomycete Neurospora crassa

Abstract

Rho-GTPasen sind kleine G-Proteine der Ras-Superfamilie, die als molekulare Schalter wirken: Im GTP-gebundenen Zustand aktivieren sie eine Vielzahl von Effektorproteinen, wohingegen sie durch die Hydrolyse des GTPs wieder inaktiviert werden. Rho-GTPasen nehmen eine Schlüsselstellung in zahlreichen Signaltransduktionswegen ein, die so grundlegende zelluläre Prozesse wie Zellmigration, Zellzyklusfortschritt und Zellpolarität regulieren. Rho-Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (RhoGEFs) und Rho-GTPase-aktivierende Proteine (RhoGAPs) beschleunigen die Bindung von Nukleotiden bzw. deren Hydrolyse durch Rho-GTPasen und bestimmen, wie zunehmend deutlich wird, in erheblichem Maß das räumliche und zeitliche Aktivitätsmuster von Rho-GTPasen. Man geht heute davon aus, dass eine präzise Regulierung von Rho-GTPasen einer der entscheidenden Faktoren ist, die die Ausbildung höchst unterschiedlicher polarer Strukturen in verschiedenen Zelltypen und Organismen ermöglichen. Daher ist die Untersuchung von Faktoren, die die Aktivität von Rho-GTPasen kontrollieren, essentiell für das Verständnis morphogenetischer Prozesse. Während die einzelligen Hefen Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe die Grundmodelle für polares Wachstum darstellen, unterscheiden sich viele Pilze, darunter auch wichtige humanpathogene Arten, von ihren beiden gut untersuchten Verwandten durch die Fähigkeit zu filamentösem Wachstum, das zur Bildung lang ausgestreckter Hyphen führt. Die molekularen Mechanismen, die dieser extremen Form polaren Wachstums zugrunde liegen, werden erst in jüngster Zeit allmählich deutlicher, aber Rho-GTPasen und ihre Regulatoren scheinen bei der Steuerung der Hyphenmorphogenese eine wesentliche Rolle zu spielen. Das Genom des filamentösen Ascomyceten Neurospora crassa, eines anerkannten Modellorganismus, kodiert für sechs Rho-GTPasen und eine große Zahl mutmaßlicher Regulatoren, von denen der Großteil zu Beginn dieser Arbeit noch nicht charakterisiert war. Mittels in vitro GEF-Aktivitätstests wurde hier die Spezifität der RhoGEFs des Pilzes bestimmt. CDC24 zeigt ausgeglichene GEF-Aktivität gegenüber RAC und CDC42, während NCU10282 bevorzugt den Nukleotidaustausch in letzterer GTPase stimuliert. BUD3 aktiviert spezifisch RHO4, und NCU00668 wirkt als RHO1-spezifischer GEF, der möglicherweise durch eine intramolekulare Wechselwirkung autoreguliert wird. Weiterhin wird gezeigt, dass CDC24 ein essentielles Protein ist, das für die Etablierung und die Aufrechterhaltung polaren Wachstums in N. crassa benötigt wird. Außerdem müssen sich RAC und CDC42 eine essentielle Funktion teilen, da ihr gleichzeitiges Fehlen synthetisch letale Defekte bedingt, die denjenigen gleichen, die bei Verlust der Funktion ihres GEFs auftreten. Die gemeinsame Lokalisation von RAC und CDC42 am Apex und an Septen wachsender Hyphen unterstützt die Vorstellung, dass sich die Funktionen der beiden GTPasen teilweise überschneiden. Auch das Fehlen von NCU00668 oder RHO1 ist letal und verhindert in den betroffenen Zellen die Ausbildung von Polarität. Übereinstimmend damit weisen temperatursensitive Mutanten, deren RHO1-Aktivität beeinträchtigt ist, Polaritätsdefekte auf, die durch gleichzeitigen Verlust von rho-2 erheblich verschlimmert werden; die einfache Deletion von rho-2 führt zu milden morphologischen Anomalien. Wachstumstests in Gegenwart verschiedener Inhibitoren und MAK1-Aktivitätsbestimmungen lassen vermuten, dass die beobachteten synthetischen Defekte auf eine Redundanz der Funktionen beider GTPasen im Erhalt der Zellwandintegrität zurückzuführen sind. Erste Wechselwirkungsanalysen deuten darauf hin, dass die Aktivität der Proteinkinase C und des Formins BNI1 nur von RHO1, nicht aber von RHO2, kontrolliert wird. Parallel stützen Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von NCU00668, RHO1 und RHO2 die Annahme, dass die Komponenten dieses GTPase Moduls sowohl gemeinsame als auch individuelle Funktionen erfüllen; allerdings sind noch weitere Analysen nötig, um die Signalwege aufzudecken, mit deren Hilfe die beiden GTPasen den Erhalt einer schützenden Zellwandstruktur während des Hyphenwachstums sicherstellen.