The role of Pcl5p and Pcl7p in the Gcn4p stability regulation of Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der Transkriptionsaktivator Gcn4p das zentrale Element der Allgemeinen Kontrolle der Aminosäurebiosynthese , der die Induktion von mehr als 500 Genen als Reaktion auf Aminosäuremangel bewirkt. Die Gcn4p-Menge in der Zelle wird überwiegend durch einen translationellen Mechanismus sowie durch Regulation der Stabilität kontrolliert. Die hohe Instabilität von Gcn4p in gesättigten Zellen beruht auf der schnellen Degradation über den Ubiquitin-Proteasom-Weg, die von der Phosphorylierung durch die Zyklin-abhängige Kinase Pho85p in Assoziation mit dem Zyklin Pcl5p initiiert wird. Pcl5p ist ein kernlokalisiertes Protein dessen Transport in den Kern von seinem C-terminus abhängig ist und vermutlich durch das β-Importin Kap95p vermittelt wird. Für die von der Aminosäureversorgung abhängige Stabilisierung von Gcn4p sind der Zyklin-abhängige Kinase Inhibitor Pho81p, sowie ein weiteres Zyklin, Pcl7p, notwendig. Es wird angenommen, dass die Stabilisierung von Gcn4p durch die Dissoziation des Pho85p/Pcl5p-Komplexes eingeleitet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von Pcl5p ein nicht klassisches NLS darstellt, das ein Motiv benötigt, in dem ein Prolin und ein Aspartat basische Aminosäuren flankieren. Der Transport von Pcl5p in den Kern erfolgt außerdem durch direkte Interaktion mit dem β-Importin Kap95p. In dieser Arbeit wurden verkürzte Pcl5p-Varianten und Pcl5p/Pho80p-Hybride verwendet, um Bereiche von Pcl5p zu identifizieren, die für die Assoziation/Dissoziation der Pho85p/Pcl5p-Komplexe, sowie Pho81p/Pcl5p-Komplexe in gesättigten bzw. in hungernden Zellen benötigt werden. Die hier durchgeführten Untersuchungen bestätigen, dass der mittlere Bereich für die Substratspezifität verantwortlich ist und zeigen, dass dieser Bereich vermutlich auch die Assoziation mit Pho85p und Pho81p vermittelt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Pcl5p unabhängig von der Verfügbarkeit von Aminosäuren mit Pho85p und Pho81p interagiert. Darüber hinaus konnte durch Überexpressionsstudien gezeigt werden, dass die Stabilisierung von Gcn4p hauptsächlich durch die geringe Menge von Pcl5p in hungernden Zellen vermittelt wird. Das stabile Zyklin Pcl7p hat hierbei nur eine indirekte Funktion. Die konkurrierende Bindung zu Pho85p wirkt der verbleibenden Pho85p/Pcl5p-Komplexbildung in hungernden Zellen entgegen.