Studies into the structural basis of the DNA uridine endonuclease activity of exonuclease III homolog Mth212

Abstract

Mth212, ein Exonuclease III Homolog aus dem Archeon Methanothermobacter thermoautotrophicus, kompensiert das Fehlen einer DNA-Uracylglycosylase (UDG), indem es einen einzelstrangbruch auf der 5 -Seite des Uridinrestes in DNA katalysiert. Diese Reaktion ersetzt die Basenexzisions Reparatur (base excision repair = BER) in einem einzigen Schritt die normalerweise aufeinander folgenden Reaktionen der UDG und einer apurinischen/apyrimidinischen (AP)-Endonuklease. Bis heute ist Mth212 das einzige Exonuklease III Homolog, für welches diese zusätzliche Aktivität gezeigt werden konnte; die strukturellen Voraussetzungen sind immer noch nicht bekannt. Um sich dieser Frage anzunehmen, wurde versucht, ExoA, einen Exonuklease-III-Homolog ohne DNA-Uridin-Endonukleaseaktivität aus B. subtilis, durch gesteuerte Evolution und gezielte Mutagenese in ein Mth212-ähnliches Enzym zu konvertieren. Bei der gesteuerten Evolution wurden exoA-mutantenbibliotheken erstellt und Ansätze entwickelt, um auf ExoA mit erworbener DNA-Uridinendonukleaseaktivität aus der Bibliothek zu selektieren. Insgesamt wurden drei Selektionsansätze, die jeweils auf B.subtilis- oder E.coli-Genetik basierten, entwickelt und getestet. Im ersten Ansatz sollte eine lytische Mutante des Bakteriophagen PBS1 von B.subtilis verwendet werden. Die DNA dieses Bakteriophagen enthält von Natur aus Uracile anstelle von Thyminen. Dieses Merkmal wurde genutzt, um die gegen Bakteriophageninfektion reistente Zellen zu selektieren. Die Verfügbarkeit der lytischen Mutante von PBS1 war die Hauptvoraussetzung für diesen Ansatz. Allerdings scheiterten alle Versuche, diese Mutante zu erzeugen. Beim zweiten Ansatz wurden Uracile in die DNA des E.coli-Bakteriophagen P2virRam3 eingefügt, jedoch erfüllte dieser Bakteriophage die Voraussetung, non-suppressor Wirtzellen zu töten, nicht und war mithin nicht geeignet, auf Zellen, die ExoA mit erworbener Aktivität exprimieren, zu selektieren. Der dritte Selektionsansatz basierte auf der Fähigkeit der DNA-Uridinendonuklease, die Reparatur von Uracil betreffenden Fehlpaarungen in der Heteroduplex-DNA zu initiieren. U/T-Fehlpaarung sollte als Teil des Stop-Kodons im für E.coli letalen ccdB-Gen eingefügt werden, sodass nicht reparierte Fehlpaarung zur Expression vollständiger, aktiver CcdB führen. Bei diesem Selektionsansatz sollten nur die Zellen die Transformation der Heteroduplex-DNA überleben, bei denen die Reparatur der U/T-Fehlpaarung durch ExoA mit Uridinexonukleaseaktivität initiiert wurde. Allerdings, konnte die Herstellung der Heteroduplex-DNA aufgrund des zytotoxischen Effektes der unterbrochenen CcdB-Proteinexpression nicht erfolgen. Es konnte nicht demonstriert werden, dass die gezielte Mutagenese von ExoA zu einer Konvertierung dieses Proteins in eine DNA-Uridinendonuklease führte. Der Austausch von Aminosäuren bewirkte eine konformationale Destabilisierung der Proteinstruktur, was in der Entstehung eines unlöslichen Proteins resultierte.