N-linked glycosylation of ether á go-go potassium channels: effects on cell surface expression and functional properties

Abstract

Ether á go-go (Eag1) ist ein spannungsabhängiger Kaliumkanal, der offenbar an einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das Protein Eag1 aus Rattengewebe vorwiegend im Gehirn exprimiert wird. Dort unterliegt es der N-Glykosylierung, einer cotranslationellen Modifizierung, welche dafür bekannt ist, die Biogenese und die funktionellen Eigenschaften von verschiedenen Plasmamembran-Proteinen zu beeinflussen. Analog unterliegt das humane Eag1 Protein auch der N-Glykosylierung, wenn es in heterologen Systemen exprimiert wird.Sowohl das humane Eag1 (hEag1), exprimiert in CHO-Zellen, als auch das Ratten Eag1, welches nativ im Gehirn exprimiert wird, besitzen zwei Isoformen, die verschiedene an Asparagin gebundene Oligosaccharide tragen. Die Untersuchung der Carbohydrat-Verknüpfung mit Endoglykosidase-Verdau zeigte zwei eindeutige Komplexe, die Core-Oligosaccharide und die Komplexen-Oligosaccharide, welche jeweils zum Molekulargewicht der hEag1 Isoformen mit 2-5 kDa bzw. 20-25 kDa beitragen. Die Mutation der Asparagin-Reste in zwei der sechs putativen N-Glykosylierungsmotive (N-X-S/T), Asn 388 und Asn 406, veränderte die Glykosylierung der hEag1 Kanäle, jedoch hatte der Austausch einer einzelner Aminosäure in den vier verbleibenden Glykosylierungsmotiven keinen Effekt auf die hEag1 Glykosylierung.Asparagin 388 ist die Verknüpfungsstelle der core-Oligosaccharide. Diese Stelle ist Endoglycosidase H-sensitiv und wird von Concanvalin A erkannt. Die Mutation dieser Stelle hatte keinen signifikanten Einfluß auf die intrazelluläre Lokalisierung und die funktionellen Eigenschaften von hEag1 Kanälen, wenngleich eine Auswirkung auf andere nicht untersuchte Zellulare Funktionen nicht ausgeschlossen werden kann. Die Komplex-Oligosaccharide, welche an Asparagin 406 gebunden sind, sind resistent gegenüber Endoglycosidase H und werden von Concanavalin A nicht erkannt. Die Bindung der Komplex-Oligosaccharide scheint eine wichtige und vielseitige Funktion zu haben, da eine Mutation von Asn 406 einen veränderten Phänotyp ergibt. Die intrazelluläre Verteilung der hEag1 Mutante, bei der die Komplex-Oligosaccharide fehlen, ist stark beeinträchtigt: anstatt eines diffusen Färbungsmusters ist eine komplexe perinukleare Lokalisierung ersichtlich. Dies ist gleichermaßen der Fall für die hEag1 Mutante, der beide Glykosylierungssstellen fehlen. Immunofluoreszenz-Experimente zeigen, dass Kanalproteine, denen die Komplex-Oligosaccharide fehlen, zumindest teilweise im Endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten werden. Dies kann zum Beispiel durch ein Problem bei der Proteinfaltung hervorgerufen durch den Verlust der Oligosaccharide-Bindgung erklärt werden. Die veränderte intrazellulären Lokalisierungen des unglykosylierten Proteins ebenso wie einer nur an einer Stelle core-glykosylierten Mutante werden wahrscheinlich nicht durch eingeführten Mutation hervorgerufen, da der gleiche Effekt bei der Expression des Wildtyp-Proteins in Zellen mit mangelnder Glykosylierung beobachtet wird. Obwohl das unglykosylierte Protein teilweise im Endoplasmatischen Retikulum festgehalten wird, muss ein wesentlicher Bestand der Mutanten-Kanäle an der Zelloberfläche exprimiert werden, da hEag1 Kaliumstöme auch in Zellen, die unglykosylierte Kanäle exprimieren - wenn auch mit stark reduzierter Amplitude - nachweisbar sind. Dagegen hat der Verlust der core-Oligosaccharide allein keinen wesentlichen Effekt auf die hEag1 Stromamplitude.Ausserdem ergibt der Verlust der Komplex-Oligosaccharide eine Verschiebung der Spannungsabhängigkeit zu positiveren Potentialen, eine Erscheinung, die auch im Fall der Desialylierung von spannungsabhängigen Natriumkanälen auftritt. Zusätzlich wurde PIAS1 als positiver hEag1 Interaktionspartner des C-terminalen hEag1 durch zwei unabhängige Yeast-Two-Hybrid Screens identifiziert. PIAS1 wird im Zellkernen exprimiert, wo es als Inhibitor der STAT-vermittelten Genaktivierung agiert. Die Hypothese, dass ein Membranprotein - oder zumindest ein Teil davon - funktionell mit einem Kernprotein interagiert, ist umstritten, obwohl sich in letzter Zeit Hinweise für solche Interaktionen häufen. Dies ist von besonderem Interesse für Eag1, in Hinsicht auf seine Mitwirkung auf Krebserkrankungen.