Structural and functional characterization of the autophagy proteins Atg5 and Atg16L1 and their interaction partners
Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Autophagieproteine Atg5 und atg16L1 und ihrer Interaktionspartner
by Amanda Marie Schalk
Date of Examination:2011-05-02
Date of issue:2011-05-26
Advisor:Dr. Karin Kühnel
Referee:Prof. Dr. Michael Thumm
Referee:Prof. Dr. Markus Wahl
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-468
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Autophagy is a degradative pathway conserved in eukaryotes. During autophagy a portion of the cytoplasm is sequestered by a de novo forming isolation membrane resulting in the formation of a double membrane vesicle. This autophagosome vesicle then fuses with the vacuole, or lysosome in animals, where its content is degraded. The Atg12-Atg5~Atg16 complex localizes to the growing isolation membrane and is essential for autophagosome formation. The complex is oligomerized via the coiled coil domain of Atg16 and this oligomerization is required for the expansion step during autophagosome formation. In this study, the oligomerization state of Atg5~Atg16L1 complexes comprising various lengths of the coiled coil domain of Atg16L1 were investigated with multiple angle laser light scattering. The coiled coil domain homo-dimerizes Atg16L1, and this in turn causes two copies each of Atg5 and Atg16L1 to be present in the complex. Several interaction partners of Atg5 and Atg16 were also characterized. For example, Atg16L1(141-265) interacts with Rab33B in a GTP-dependent manner (Itoh 2008). In this study it was shown that residues 172-234 of Atg16L1 are sufficient for binding. Crystals of the Rab33B(30-202)Q92L~Atg16L1(141-265) complex were grown, however they did not diffract. Furthermore, I showed that calpain cleaves Atg16L1 but not Atg5. Cleavage of autophagy proteins by calpain could play a role in the regulation of autophagy.
Keywords: Autophagy; Atg5; Atg16
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Autophagie ist ein konservierter eukaryotischer Prozess durch den zelleigene Bestandteile abgebaut werden. Ein Teil des Cytoplasmas wird durch eine sich de novo bildende Isolationsmembran eingeschlossen. Dabei wird ein Vesikel, dass von zwei Membranen umschlossen wird gebildet. Dieses Autophagosomvesikel fusioniert mit dem Lysosom in tierischen Zellen oder der Vakuole in Hefe. Der für die Ausbildung von Autophagosomvesikeln essentielle Atg12-Atg5~Atg16 Komplex assoziiert mit der wachsenden Isolationsmembran. Dieser Komplex oligomerisiert über die Coiled-Coil Domäne von Atg16 und diese Multimerisierung ist notwendig für das Wachstum der Isolationsmembran. In dieser Arbeit wurde das Oligomerisierungsverhalten von Atg5~Atg16L1 Komplexen mit unterschiedlich langen Atg16 Konstrukten untersucht und mittels Multiwinkel-Laserlichtstreuung analysiert. Die Coiled-Coil Domäne von Atg16L1 dimerisiert, so dass jeweils zwei Kopien von Atg5 und Atg16L1 im Atg5~Atg16L1 Komplex vorliegen. Weiterhin wurden verschiedene Interaktionspartner von Atg5 und Atg16 charakterisiert. Atg16L1(141-265) bindet GTP gebundenes Rab33B (Itoh 2008). Ich konnte zeigen, dass die Atg16L1 Region 172-234 ausreichend für diese Interaktion ist. Ich konnte Kristalle des Rab33B(30-202)Q92L~Atg16L1(141-265) züchten, aber sie haben nicht gestreut. In weiteren Experimenten konnte ich zeigen, dass die Protease Calpain Atg16L1 aber nicht Atg5 schneidet. Die Spaltung von Autophagie-Proteinen durch Calpain könnte wichtig für die Regulation der Autophagie sein.
Schlagwörter: Autophagie; Atg5; Atg16