Der Einfluss der Glutamatdehydrogenasen auf die Verknüpfung des Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsels in Bacillus subtilis

Abstract

Glutamat ist der zentrale Aminogruppendonor für alle stickstoffhaltigen Verbindungen in der Zelle. In dem Gram-positiven Bodenbakterium Bacillus subtilis wird Glutamat ausschließlich in den gekoppelten Reaktionen der Glutaminsynthetase und der Glutamatsynthase synthetisiert. Da für den Aufbau von Glutamat 2 Oxoglutarat aus dem Citrat Zyklus benötigt wird, stellt die Glutamatsynthese einen wichtigen Knotenpunkt zwischen dem Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsel dar. Deshalb ist die Expression der beteiligten Enzyme streng reguliert. Der Abbau von Glutamat wird von der Glutamatdehydrogenase RocG katalysiert. Durch die geringe Affinität zu Ammonium kann dieses Enzym nicht die Synthese von Glutamat katalysieren. Neben der enzymatischen Funktion reguliert RocG die Aktivität des Transkriptionsregulators GltC, der bedeutend für die Expression der Glutamatsynthase ist. In dieser Arbeit wurden mutierte RocG-Varianten isoliert und charakterisiert. Durch einen Aminosäureaustausch wurden die beiden Funktion von RocG voneinander getrennt. Eine Klasse von Varianten inaktiviert GltC sehr stark und ist in ihrer zeigt enzymatischen Aktivität schwer beeinträchtigt. Die zweite Klasse kann GltC nicht mehr inhibieren, zeigt aber enzymatische Aktivität. Diese Ergebnisse geben einen Einblick in den regulatorischen Mechanismus der RocG-GltC Interaktion. B. subtilis 168 kodiert für eine zweite Glutamatdehydrogenase, GudB. Im Laborstamm 168 ist das gudB-Gen durch eine direkte Wiederholung von neun Basenpaaren kryptisch. Beim Wachstum einer rocG-Mutante auf Komplexmedium wird das gudB-Allel schnell dekryptifiziert, wobei immer eine Hälfte der Sequenzwiederholung deletiert wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die gudB-Mutation mit einer extrem hohen Rate von 10-4 auftritt. Außerdem wurde bewiesen, dass eine perfekte Basen-wiederholung für die hohe Mutationsrate notwendig ist. Darüber hinaus zeigte sich in einem artifiziellen Mutagenese-System, dass die Transkription für die hohe Mutationsrate des gudB-Gens notwendig ist. Das Mfd Protein, welches die Transkription mit der DNA Reparatur koppelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der Dekryptifizierung des gudB Gens. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die herausragende Bedeutung der Glutamathomöostase in B. subtilis.