Isolation and characterisation of synaptic vesicles from mouse brain

Ahmed, Saheeb

dc.contributor.advisor	Jahn, Reinhard Prof. Dr.	de
dc.contributor.author	Ahmed, Saheeb	de
dc.date.accessioned	2012-04-16T14:55:01Z	de
dc.date.available	2013-01-30T23:50:37Z	de
dc.date.issued	2011-08-08	de
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AE1B-8	de
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-485
dc.description.abstract	Alle Eukariotischen Zellen führen einen konstanten Transport von Membranekomponenten duch Vesikel zwischen den Subzellulären Kompartimenten durch. Ein klassichen Beispiel für diesen Transport sind synaptische Vesikel, welche eine wichtige Rolle in der Ausschüttung von Neurotransmitter spielen. Biochemische Analysen von Aufgereinigten synaptischen Vesikeln war von Bedeutung, für die Identifikation und Verständniss der involvierten Proteine in der Membrane Fusion und Aufnahme von Neurotransmittern. Mehrere Protokolle für die Aufreinigung der synaptischen Vesikel auf tierischem Gerhirn wurden etabliert. Einige Protokolle die zu sher sauber aufgereinigten Vesikeln fürhten hatten den Nachteil das die Ausbeute sehr gering war. Hier beschreibe Ich eine Verbesserte Methode zur Aufreinigung von synaptischen Vesikeln, bei dem sehr geringes Ausgangsmaterial benötigt wird. Diese Methode setzt Etablierte Fraktionierungstechnicken, wie Differentielle zentrifugation, rate-zonal Zentrifugation und Chromatographie techniken ein. Diese Protokoll ist optimiert hinsichtilich der Ausbeute an synaptischen Vesikeln während der Aufreinigung, wobei die Sauberkeit der finalen Vesikel Fraktion mit der durch etablierte Protokolle gewonnen Vesikelfraktion vergleichbar ist. Ein weitere Vorteil diese methode ist die Zeitersparniss gegenüber klassicher Methoden. An Hand von Immunoblots und Elektronenmikroskopischen Aufnahmen kann die Sauberkeit der gewonnen Vesikel Fraktion gezeitgt werden. Durch den Einsatz an gerimgem Ausgangsmaterial, können synaptische Vesikel auf Transgenen Mäusen isoliert und die Neurotransmitterfreisetzung im Detail untersucht werden. Zu diesem zewck wurden synaptische Vesikel auf Rab-GDI knock-out Mäusen isolierten und deren Biochemischen und Physikalischen Parameter analysiert.	de
dc.format.mimetype	application/pdf	de
dc.language.iso	eng	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/	de
dc.title	Isolation and characterisation of synaptic vesicles from mouse brain	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Isolierung und Charakterisierung synaptischer Vesikel auf Mäuse Hirn	de
dc.contributor.referee	Jahn, Reinhard Prof. Dr.	de
dc.date.examination	2010-11-02	de
dc.subject.dnb	500 Naturwissenschaften	de
dc.description.abstracteng	All eukaryotic cells exhibit a constant turnover of membrane components via trafficking of vesicles between subcellular compartments. A classical example of a dynamic membrane delimited organelle exhibiting a high degree of complexity in terms of structure and function is the synaptic vesicle (SV), which participates in the release of neurotransmitter from neurons. Biochemical analysis of purified SVs was instrumental in the identification and understanding of proteins involved in exocytotic membrane fusion and neurotransmitter uptake. Numerous protocols have been established detailing the isolation of SVs from brain. Protocols resulting in highly purified vesicles often have extremely low yields compared to the starting material required. Here I describe an improved protocol for the small-scale isolation of synaptic vesicles from mouse and rat brain. The procedure relies on standard fractionation techniques, including differential centrifugation, rate-zonal centrifugation and size-exclusion chromatography. The protocol has been optimised to minimize vesicle loss and increase yield during preparation while maintaining a high degree of purity. The protocol can be completed in a very short time compared to classical protocols. Immunoblotting and electron micrographs showed high purity, enrichment profile of one of the most abundant vesicle protein synapotphysin revealed maximum enrichment in the final SV fraction. This opens the possibility to purify SVs from genetically modified mice to further explore the biochemistry of the neurotransmitter release process. Therefore, I purified SVs from Rab-GDI knock-out mice to ensure the applicability of this new protocol. Furthermore, I carried out the biochemical and morphological characterisation of mouse SVs and compared them to rat SVs. To determine any differences of SVs between these two species, physical parameters were analysed like diameter, mass and density. I found that SVs from mouse and rat are relatively similar except for minor differences in their physical p arameters, protein and lipid compositions. To characterise the role of SNARE proteins in membrane fusion and to check for the fusogenic properties of the purified vesicles, in-vitro fusion assays were performed with liposomes containing syntaxin 1 and SNAP-25 and glutamate uptake as a general function was monitored.	de
dc.contributor.coReferee	Brose, Nils Prof. Dr.	de
dc.contributor.thirdReferee	Neher, Erwin Prof. Dr.	de
dc.subject.topic	Biology (incl. Psychology)	de
dc.subject.ger	Synaptische Vesikel	de
dc.subject.ger	Neurotransmitter	de
dc.subject.ger	SNARE´s	de
dc.subject.ger	Fusion	de
dc.subject.eng	Synaptic vesilces	de
dc.subject.eng	Neurotransmitter	de
dc.subject.eng	SNARE´s	de
dc.subject.eng	Fusion	de
dc.subject.bk	42.15	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3085-2	de
dc.identifier.purl	webdoc-3085	de
dc.affiliation.institute	Biologische Fakultät inkl. Psychologie	de
dc.subject.gokfull	WA 000: Biologie	de
dc.identifier.ppn	668679506	de

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Fakultät für Biologie und Psychologie (inkl. GAUSS) [1620]

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