Charakterisierung eines neuen ATP-binding-cassette Transporters aus der ABCA-Subfamilie
Characterisation of a novel ATP-binding-cassette transporter of the ABCA subfamily
by Frauke Petry
Date of Examination:2004-06-30
Date of issue:2004-09-08
Advisor:Prof. Dr. Axel Zeeck
Referee:Prof. Dr. Axel Zeeck
Referee:Prof. Dr. Hartmut Laatsch
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-489
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Description:Dissertation
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Abstract
English
This thesis describes the identification and characterisation of the novel ATP-binding-cassette gene ABCA5 and its putative rat orthologue rAbca5.ABCA5 was isolated and cloned from the human hepatoma cell line HepG2. It comprises an open reading frame (ORF) of 4926 bp and encodes a protein of 1642 amino acids. According to computer modelling studies the ABCA5 protein consists of two transmembrane and two nucleotide binding domains (ABC cassettes) exhibiting the typical topology of an ABC full transporter. mRNA expression studies revealed expression in skeletal muscle, kidney, liver and placenta. A truncated mRNA transcript (ABCA5 V20+16) that might stem from an alternative splice event was isolated during cloning experiments and contained a 16 bp insertion at the 3' terminus of exon 20 leading to a frame shift and thus to a premature translational stop codon after 925 amino acids. The putative topology of ABCA5 V20+16 corresponds to an ABC half transporter.The putative rat orthologue rAbca5 was isolated from total testis RNA of male Wistar rats. This gene contains an identical ORF of 4926 bp and reveals sequence identity of 90% with respect to the polypeptide sequence of human ABCA5. High mRNA expression of rAbca5 was found in testis, lung and brain. In situ hybridisation was used to further examine mRNA expression in rat testis tissue. As for human ABCA5 an alternative rat transcript rAbca5 V+16 was found containing an orthologous 16 bp insertion at the 3' terminus of exon 20. The relative abundance of rAbca5 V+16 with respect to the main rAbca5 mRNA transcript was determined for a selection of rat tissues and a rat cell line by means of quantitative real-time PCR.On the basis of primary rat hepatocyte cell culture it could be shown that mRNA expression of rAbca5 is affected e.g. by the duration of culture and the presence of LXR activators.To examine the subcellular localisation of rAbca5 and its splice variant rAbca5 V+16 both ORFs were used to construct expression plasmids containing an epitope tag (V5, EGFP) at the C-terminus of the respective gene. These fusion plasmids were transfected into various cell lines. EGFP fusion proteins were detected by means of fluorescence microscopy for both rAbca5 and rAbca5 V+16 in HEK293 and Caco-2 cells. The localisation of these fusion proteins was equally assigned to intracellular compartments in close vicinity to the nucleus.
Keywords: ATP binding cassette; ABC transporter; characterisation; ABCA5; splice variant; full transporter; half transporter; in situ hybridisation; hepatocytes; EGFP; fluorescence; localisation
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Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit ABCA5 aus Gesamt-RNA der humanen Hepatomzell-Linie HepG2 ein neues Mitglied der ABCA-Subfamilie aus der Superfamilie der ABC-Proteine isoliert und charakterisiert. Das ABCA5-Gen umfasst einen offenen Leserahmen (OLR) von 4926 bp und kodiert für ein Protein der Länge von 1642 Aminosäuren. Die mittels Computermodellen vorhergesagte Proteintopologie ergibt die Struktur eines typischen Volltransporters mit zwei Membrandomänen und zwei Nukleotidbindungsregionen (ABC-Kassetten). Anhand von Northern-Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass das humane ABCA5-Gen am stärksten im Skelettmuskel, der Niere, Leber und der Plazenta exprimiert wird. Es wurde ein Produkt eines alternativen Splicevorgangs isoliert und charakterisiert, das sich durch eine 16 bp-Insertion am 3'-Terminus des Exons 20 vom Haupttranskript unterscheidet (ABCA5 V20+16). Diese Insertion verursacht eine Verschiebung des offenen Leserahmens und infolge den Translationsabbruch nach 925 Aminosäuren. Die putative Struktur von ABCA5 V20+16 entspricht der eines ABC-Halbtransporters.Aus Gesamt-RNA des Testis der Ratte (Wistar) wurde das vermutlich orthologe Gen rAbca5 isoliert und charakterisiert. rAbca5 besitzt einen OLR von 4926 bp und zeigt eine Sequenzidentität zum humanen ABCA5-Gen von 90% auf Basis der Aminosäureabfolge. Das mRNA-Expressionsprofil für rAbca5 zeigt eine dominante Expression im Testis und hohe Expressionsniveaus in Lunge und Gehirn und wurde mit Hilfe von in situ Hybridisierungen an Testisgewebeproben der Ratte weiter untersucht. Auch für rAbca5 wurde eine Splicevariante V+16 isoliert, die eine nahezu identische 16 bp-Insertion am 3'-Terminus des Exon 20 enthält. Die Häufigkeit der Splicevariante rAbca5 V+16 im Verhältnis zum vollständigen rAbca5-Gen wurde in verschiedenen Geweben der Ratte und einer Zell-Linie mittels quantitativer real-time-PCR evaluiert.Die Regulationsstudien in Kulturen primärer Hepatozyten der Ratte zeigten, dass die mRNA-Expression von rAbca5 durch verschiedene Faktoren, z.B. durch die Kulturdauer und LXR-Aktivatoren, beinflusst wird.Zur Klärung der subzellulären Lokalisation von rAbca5 wurden das vollständige Gen und die Splicevariante in Expressionsvektoren mit Epitop-Tag (V5, EGFP) eingebracht und als Fusionsproteine in verschiedenen Zellsystemen exprimiert. Die EGFP-Fusionsproteine für den Volltransporter (rAbca5) und die Splicevariante (rAbca5 V+16) wurden in HEK293- und Caco-2-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Die Lokalisation beschränkt sich für beide Konstrukte auf intrazelluläre Kompartimente in Kernnähe.
Schlagwörter: ATP-binding-cassette; ABC-Transporter;Charakterisierung; ABCA5; Splicevariante; Volltransporter; Halbtransporter; in situ Hybridisierung; Hepatozyten; EGFP; Fluoreszenz; Lokalisation
