Charakterisierung eines neuen ATP-binding-cassette Transporters aus der ABCA-Subfamilie

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit ABCA5 aus Gesamt-RNA der humanen Hepatomzell-Linie HepG2 ein neues Mitglied der ABCA-Subfamilie aus der Superfamilie der ABC-Proteine isoliert und charakterisiert. Das ABCA5-Gen umfasst einen offenen Leserahmen (OLR) von 4926 bp und kodiert für ein Protein der Länge von 1642 Aminosäuren. Die mittels Computermodellen vorhergesagte Proteintopologie ergibt die Struktur eines typischen Volltransporters mit zwei Membrandomänen und zwei Nukleotidbindungsregionen (ABC-Kassetten). Anhand von Northern-Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass das humane ABCA5-Gen am stärksten im Skelettmuskel, der Niere, Leber und der Plazenta exprimiert wird. Es wurde ein Produkt eines alternativen Splicevorgangs isoliert und charakterisiert, das sich durch eine 16 bp-Insertion am 3'-Terminus des Exons 20 vom Haupttranskript unterscheidet (ABCA5 V20+16). Diese Insertion verursacht eine Verschiebung des offenen Leserahmens und infolge den Translationsabbruch nach 925 Aminosäuren. Die putative Struktur von ABCA5 V20+16 entspricht der eines ABC-Halbtransporters.Aus Gesamt-RNA des Testis der Ratte (Wistar) wurde das vermutlich orthologe Gen rAbca5 isoliert und charakterisiert. rAbca5 besitzt einen OLR von 4926 bp und zeigt eine Sequenzidentität zum humanen ABCA5-Gen von 90% auf Basis der Aminosäureabfolge. Das mRNA-Expressionsprofil für rAbca5 zeigt eine dominante Expression im Testis und hohe Expressionsniveaus in Lunge und Gehirn und wurde mit Hilfe von in situ Hybridisierungen an Testisgewebeproben der Ratte weiter untersucht. Auch für rAbca5 wurde eine Splicevariante V+16 isoliert, die eine nahezu identische 16 bp-Insertion am 3'-Terminus des Exon 20 enthält. Die Häufigkeit der Splicevariante rAbca5 V+16 im Verhältnis zum vollständigen rAbca5-Gen wurde in verschiedenen Geweben der Ratte und einer Zell-Linie mittels quantitativer real-time-PCR evaluiert.Die Regulationsstudien in Kulturen primärer Hepatozyten der Ratte zeigten, dass die mRNA-Expression von rAbca5 durch verschiedene Faktoren, z.B. durch die Kulturdauer und LXR-Aktivatoren, beinflusst wird.Zur Klärung der subzellulären Lokalisation von rAbca5 wurden das vollständige Gen und die Splicevariante in Expressionsvektoren mit Epitop-Tag (V5, EGFP) eingebracht und als Fusionsproteine in verschiedenen Zellsystemen exprimiert. Die EGFP-Fusionsproteine für den Volltransporter (rAbca5) und die Splicevariante (rAbca5 V+16) wurden in HEK293- und Caco-2-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Die Lokalisation beschränkt sich für beide Konstrukte auf intrazelluläre Kompartimente in Kernnähe.