Structural characterization of the two copper proteins nitrous oxide reductase from Pseudomonas stutzeri and laccase Lcc5 from Coprinopsis cinerea

Abstract

Obwohl die Reduktion von Distickstoffoxid (N2O) stark exergonisch ist, verhindert eine hohe Aktivierungsenergie eine spontane Reaktion. Wie Distickstoff benötigt N2O ein komplexes Metallzentrum, um aktiviert zu werden. Das einzige bekannte Enzym, welches die Reduktion von N2O zu N2 katalysieren kann, ist das sauerstoffempfindliche Protein Distickstoffmonoxidreduktase (N2OR). Kristallographische Untersuchungen an diesem Protein aus Paracoccus denitrificans, Marinobacter hydrocarbonoclasticus und Achromobacter cycloclastes ermöglichten Einblicke in dessen Struktur: Das Protein formt ein "Head-to-Tail"-Dimer, dessen Bildung notwendig für die enzymatische Reaktion ist. Jedes Monomer besteht aus zwei separaten Domänen, einem N-terminalen β-Propeller mit dem tetranuclear CuZ-Zentrum und einer C-terminalen Cupredoxin-ähnlichen Domäne, welche ein gemischt-valentes CuA-Zentrum trägt, ähnlich dem der Cytochrom c Oxidase. Diese N2O-Reduktasestrukturen repräsentieren jedoch aerob isoliertes Protein, welches nur aktiv ist, nach einer verlängerten Inkubation mit Reduktionsmitteln. Im Gegensatz hierzu zeigt die violette Form der Distickstoffoxidreduktase aus Pseudomonas stutzeri physiologische Aktivität, ohne dass eine vorherige reduktive Aktivierung notwendig ist. In dieser Arbeit wird sowohl die erste Kristallstruktur der physiologisch aktiven Form der N2O-Reduktase als auch die erste Struktur eines Metall-N2O-Komplexes beschrieben. Dies ermöglicht neue Erkenntnisse hinsichtlich des Bindungsmodus von N2O an das katalytische Zentrum. In mit N2O-begasten Kristallen bindet Distickstoffoxid zwischen dem CuA und dem CuZ-Zentrum. Das CuA-Zentrum ist wie bereits früher beschrieben ein gemischt-valentes Zentrum, welches zwischen dem oxidiertem [Cu+1.5:Cu+1.5] und dem reduziertem [Cu+:Cu+] Zustand alterniert und dadurch ein Elektron pro Zyklus zur Verfügung stellt. Im Gegensatz zu früheren Strukturen ist der Histidinligand von CuA1 flexibel und rotiert abhängig von der Anwesenheit des Substrats, um Wasserstoffbrücken zu einem nahegelegenem Serin- und Aspartatrest zu bilden. Desweiteren zeigt das CuZ einen entscheidenden strukturellen Unterschied zu früheren Beschreibungen. An der Kante von CuZ1 und CuZ4 befindet sich anstelle des beschriebenen Wassermoleküls ein zweiter Schwefel. Dieser ermöglicht die Erklärung verschiedener spektroskopischer Beobachtungen bei den einzelnen Enzymformen. CuZ der violetten Distickstoffoxidreduktase aus Pseudomonas stutzeri ist daher ein [4Cu:2S] Zentrum, wohingegen das [4Cu:1S] Cluster, welches zuvor bei anderen Formen beobachtet wurde, das CuZ* Zentrum repräsentiert. Der zweite Schwefel stabilisiert vermutlich die Geometrie von CuZ und könnte daher Voraussetzung für eine erfolgreiche Substratbindung darstellen. Der Bindungsmodus von N2O deutet an, dass CuZ und CuA als ein aktives Zentrum fungieren, um das Substrat zu reduzieren.