Secretome Analysis in Higher Basidiomycetes - Freely Secreted and Cell Wall Proteins from Coprinopsis cinerea
Sekretomanalyse in höheren Basidiomyceten - Frei sekretierte und Zellwand gebundene Proteine in Coprinopsis cinerea
by Dorothea Güttel
Date of Examination:2010-09-29
Date of issue:2011-09-05
Advisor:Prof. Dr. Ursula Kües
Referee:Prof. Dr. Ursula Kües
Referee:Prof. Dr. Reiner Finkeldey
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Name:guettel.pdf
Size:31.3Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Basidiomycetes secrete numerous proteins not only into the extracellular space but as well into extracellular structures as the cell wall and the associated polysaccharide layer (hyphal sheath). A detailed overview of the secretome of Coprinopsis cinerea fractionated into freely secreted proteins, proteins of the hyphal sheath and cell wall proteins is given in this thesis. The cell wall proteins were further fractionated: into ionically bound proteins, into other covalently bound proteins and proteins associated by disulphide bridges and covalently bound proteins. The single extractable fractions were analyzed by proteomic methods and the proteins were identified by mass spectrometrie (LC-MS2). At the beginning of this work, an optimized protein preparation protocol applicable for various higher basidiomyctes was established. To analyze the fractionated secretome in the early exponential growth phase two proteomic techniques were applied: a 2-DE gel approach in combination with protein identification by LCMS2 and in parallel a one-dimensional (1-DE) shotgun approach for the identification of proteins by LC-MS2. Both methods showed a clear compartmentation between the cell wall proteome on the one hand and the freely secreted and the hyphal sheath proteome on the other hand. Only few of the identified proteins were overlapping between the free secretome and the hyphal sheath proteome on the one hand and the fractions of the cell wall proteome on the other hand. In total, 162 proteins in five different fractions (with overlappings) were identified in this experimental setup. The identified proteins from the free secretome and the hyphal sheath included mainly glycoside hydrolases, peptidases and oxidoreductases, all putative enzymes involved in nutrient supply. Within the cell wall, proteins with putative functions in the cell wall formation and restructuring (e.g. chitinases, mannosidases) were detected. Also enzymes known from intracellular processes were identified and thus could possibly be located in the cell wall of C. cinerea. Although the existence of such typically intracellular proteins in the cell wall of fungi was already shown previously, the extracellular function of these proteins is controversial. Further analysis of the fractionated secretome of C. cinerea over the time of cultivation revealed a dynamic secretome, possibly an adaption to the changing environmental conditions. The secretome showed a reduced complexity over the time. Contrary, single proteins such as peptidases and glycoside hydrolases changed significantly in their concentration over the time of cultivation, as visible in the 2-DE gels. In conclusion, these experimental setups revealed a dynamic and strictly compartmented secretome of C. cinerea. The analysis of the C. cinerea secretome by 2-DE showed that many of the extracellular proteins have extensive posttranslational modifications (PTM). The freely secreted proteins of C. cinerea were found to be highly glycosylated. In addition, experiments with radioactively labeled phosphate revealed evidence that specifically phosphorylated proteins are present in the secretome of C. cinerea. The analysis of the fractionated secretome from C. cinerea grown in liquid medium gave an overview concerning the nature and the dynamics of the secretome over the time and gave an overview of the secretome from C. cinerea in liquid cultures. However, for a deeper insight into substrate degradation and the cell wall formation of fungi, an analysis on natural substrate is crucial. In course of this work, it could be shown that the methods developed for C. cinerea in liquid culture are as well applicable to fungi growing on natural substrate, as demonstrated for Pleurotus ostreatus strain PC9 grown on wheat straw for a period of 31 days.
Keywords: proteomics; basidiomycetes; Coprinopsis cinerea; cell wall; cell wall proteins
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Basidiomyceten sekretieren eine Vielzahl an Proteinen nicht nur in ihre weitere Umgebung, sondern auch in extrazelluläre Strukturen wie der Zellwand und der damit assoziierten äußeren Polysaccharid-Schicht. Ein detaillierter Überblick über das Sekretom von Coprinopsis cinerea fraktioniert in frei sekretierte Proteine, in Proteine der äußeren Polysaccharid-Schicht, welche die Hyphen umgibt, und in Proteine der pilzlichen Zellwand wurde in dieser Arbeit geschaffen. Letztere wurden in folgende Fraktionen unterteilt: in ionisch gebundene Zellwandproteine, in andere durch nicht kovalente Bindungen assoziierte Zellwandproteine sowie über Disulfidbrücken gebundene Proteine und in kovalent gebundene Zellwandproteine. Die einzelnen extrahierbaren Fraktionen wurden mit proteomischen Methoden untersucht, um ihre Proteine mittels Massenspektrometrie (LC-MS2) zu identifiziert. Zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit wurde mangels geeigneter Methoden ein optimiertes Protokoll zur Aufarbeitung von frei sekretierten Proteinen von C. cinerea und anderen höheren Basidiomyceten etabliert. Zur Analyse des fraktionierten Sekretoms in der frühen exponentiellen Wachstumsphase wurden zwei proteomische Techniken angewandt: zweidimensionale Gelelektrophorese in Kombination mit LC-MS2 zur Identifizierung von definierten Proteinspots, sowie eine eindimensionale Gelelektrophorese als Shotgun-Untersuchung zur Identifizierung von Proteinen in Proteingemischen mittels LC-MS2. Aus beiden Experimenten wurde deutlich, dass sich das Proteom außerhalb der Zellwand (frei sekretierte Proteine sowie Proteine der Polysaccharid-Schicht) und das Zellwandproteom signifikant voneinander unterscheiden. Nur wenige der identifizierten Proteine waren in der frei sekretierten Proteinfraktion und der Proteinfraktion der Polysaccharidschicht einerseits und den Zellwandproteinfraktionen andererseits vorhanden. Insgesamt wurden im Zuge dieser Versuchsreihe 162 Proteine (mit Überlappungen) identifiziert. In der frei sekretierten Fraktion und in der Proteinfraktion aus der Polysaccharid-Schicht wurden hauptsächlich Glykosid-Hydrolasen, Proteasen und Oxidoreductasen isoliert. Diese sind höchst wahrscheinlich der Substrataufnahme dienlich. In der Zellwand konnten einige Proteine mit möglichen Funktionen im Zellwandaufbau, wie zum Beispiel Glykosyltransferasen, Mannosidasen und Chitinasen identifiziert werden. Des Weiteren wurden aber auch Enzyme identifiziert, welche normalerweise in intrazelluläre Prozesse involviert sind. Obwohl die Existenz dieser Enzyme in den Zellwänden von Pilzen in mehreren Fällen eindeutig nachgewiesen werden konnte, ist ihre Funktion in der Zellwand umstritten. Es konnte gezeigt werden, dass sich alle Fraktionen des Sekretoms von C. cinerea dynamisch mit der Zeit veränderten, möglicherweise als eine Anpassung an die sich ändernden Umweltbedingungen während des Wachstums. Es zeigte sich, dass das fraktionierte Sekretom im Laufe des Wachstums an Komplexität verliert. Im Gegensatz dazu variierten einzelne Proteine wie z.B. Peptidasen oder Glykosidhydrolasen signifikant in ihrer Konzentration. Abschließend entstand das Bild eines hoch diversen, dynamischen Sekretoms in Hinsicht auf die Konzentration einzelner Proteine von C. cinerea, welches signifikante Unterschiede zwischen dem frei sekretierten und dem Zellwandproteom aufweist. Die 2-DE Untersuchung des fraktionierten Sekretoms von C. cinerea zeigte weiters, dass viele extrazelluläre Proteine von C. cinerea stark post-translatorisch modifiziert sind. Eine extensive Glykosylierung des freien Sekretoms konnte nachgewiesen werden. Versuche mit radioaktiv markiertem Phosphat lieferten außerdem Hinweise auf spezifische, phosphorylierte Proteine im Sekretom vom C. cinerea. Die Experimente zur Untersuchung des Sekretoms von C. cinerea bei Kultivierung in Flüssigmedium konnten einen Überblick bezüglich der Kompartimentierung, der Beschaffenheit und der Dynamik der sekretierten Proteine von C. cinerea in flüssigem Medium schaffen. Für einen tieferen Einblick in Substratabbau und Zellwandaufbau, ist jedoch eine Untersuchung der Pilze auf naturnahem Substrat unumgänglich. Im Zuge dieser Arbeit konnte für den holzabbauenden Pilz Pleurotus ostreatus (Stamm PC9) gezeigt werden, dass die zuvor an C. cinerea in Flüssigmedium entwickelten Methoden bedingt auch auf naturnahem Substrat (Weizenstroh) angewendet werden können.
Schlagwörter: Proteomik; Basidiomyceten; Coprinopsis cinerea; Zell wand; Zellwandproteine