Secretome Analysis in Higher Basidiomycetes - Freely Secreted and Cell Wall Proteins from Coprinopsis cinerea

Abstract

Basidiomyceten sekretieren eine Vielzahl an Proteinen nicht nur in ihre weitere Umgebung, sondern auch in extrazelluläre Strukturen wie der Zellwand und der damit assoziierten äußeren Polysaccharid-Schicht. Ein detaillierter Überblick über das Sekretom von Coprinopsis cinerea fraktioniert in frei sekretierte Proteine, in Proteine der äußeren Polysaccharid-Schicht, welche die Hyphen umgibt, und in Proteine der pilzlichen Zellwand wurde in dieser Arbeit geschaffen. Letztere wurden in folgende Fraktionen unterteilt: in ionisch gebundene Zellwandproteine, in andere durch nicht kovalente Bindungen assoziierte Zellwandproteine sowie über Disulfidbrücken gebundene Proteine und in kovalent gebundene Zellwandproteine. Die einzelnen extrahierbaren Fraktionen wurden mit proteomischen Methoden untersucht, um ihre Proteine mittels Massenspektrometrie (LC-MS2) zu identifiziert. Zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit wurde mangels geeigneter Methoden ein optimiertes Protokoll zur Aufarbeitung von frei sekretierten Proteinen von C. cinerea und anderen höheren Basidiomyceten etabliert. Zur Analyse des fraktionierten Sekretoms in der frühen exponentiellen Wachstumsphase wurden zwei proteomische Techniken angewandt: zweidimensionale Gelelektrophorese in Kombination mit LC-MS2 zur Identifizierung von definierten Proteinspots, sowie eine eindimensionale Gelelektrophorese als Shotgun-Untersuchung zur Identifizierung von Proteinen in Proteingemischen mittels LC-MS2. Aus beiden Experimenten wurde deutlich, dass sich das Proteom außerhalb der Zellwand (frei sekretierte Proteine sowie Proteine der Polysaccharid-Schicht) und das Zellwandproteom signifikant voneinander unterscheiden. Nur wenige der identifizierten Proteine waren in der frei sekretierten Proteinfraktion und der Proteinfraktion der Polysaccharidschicht einerseits und den Zellwandproteinfraktionen andererseits vorhanden. Insgesamt wurden im Zuge dieser Versuchsreihe 162 Proteine (mit Überlappungen) identifiziert. In der frei sekretierten Fraktion und in der Proteinfraktion aus der Polysaccharid-Schicht wurden hauptsächlich Glykosid-Hydrolasen, Proteasen und Oxidoreductasen isoliert. Diese sind höchst wahrscheinlich der Substrataufnahme dienlich. In der Zellwand konnten einige Proteine mit möglichen Funktionen im Zellwandaufbau, wie zum Beispiel Glykosyltransferasen, Mannosidasen und Chitinasen identifiziert werden. Des Weiteren wurden aber auch Enzyme identifiziert, welche normalerweise in intrazelluläre Prozesse involviert sind. Obwohl die Existenz dieser Enzyme in den Zellwänden von Pilzen in mehreren Fällen eindeutig nachgewiesen werden konnte, ist ihre Funktion in der Zellwand umstritten. Es konnte gezeigt werden, dass sich alle Fraktionen des Sekretoms von C. cinerea dynamisch mit der Zeit veränderten, möglicherweise als eine Anpassung an die sich ändernden Umweltbedingungen während des Wachstums. Es zeigte sich, dass das fraktionierte Sekretom im Laufe des Wachstums an Komplexität verliert. Im Gegensatz dazu variierten einzelne Proteine wie z.B. Peptidasen oder Glykosidhydrolasen signifikant in ihrer Konzentration. Abschließend entstand das Bild eines hoch diversen, dynamischen Sekretoms in Hinsicht auf die Konzentration einzelner Proteine von C. cinerea, welches signifikante Unterschiede zwischen dem frei sekretierten und dem Zellwandproteom aufweist. Die 2-DE Untersuchung des fraktionierten Sekretoms von C. cinerea zeigte weiters, dass viele extrazelluläre Proteine von C. cinerea stark post-translatorisch modifiziert sind. Eine extensive Glykosylierung des freien Sekretoms konnte nachgewiesen werden. Versuche mit radioaktiv markiertem Phosphat lieferten außerdem Hinweise auf spezifische, phosphorylierte Proteine im Sekretom vom C. cinerea. Die Experimente zur Untersuchung des Sekretoms von C. cinerea bei Kultivierung in Flüssigmedium konnten einen Überblick bezüglich der Kompartimentierung, der Beschaffenheit und der Dynamik der sekretierten Proteine von C. cinerea in flüssigem Medium schaffen. Für einen tieferen Einblick in Substratabbau und Zellwandaufbau, ist jedoch eine Untersuchung der Pilze auf naturnahem Substrat unumgänglich. Im Zuge dieser Arbeit konnte für den holzabbauenden Pilz Pleurotus ostreatus (Stamm PC9) gezeigt werden, dass die zuvor an C. cinerea in Flüssigmedium entwickelten Methoden bedingt auch auf naturnahem Substrat (Weizenstroh) angewendet werden können.