Kartierung von umhüllungsrelevanten Aminosäureresten auf dem Hepatitis B Virus Kapsid
Mapping of amino acid residues on the hepatitis B virus capsid involved in its envelopment
von Dirk Ponsel
Datum der mündl. Prüfung:2003-11-05
Erschienen:2004-07-30
Betreuer:Prof. Dr. Gerhard Gottschalk
Gutachter:PD Dr. Harald Kolmar
Gutachter:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
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http://dx.doi.org/10.53846/goediss-498
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Zusammenfassung
Englisch
During morphogenesis of the hepatitits B virus (HBV) the cytosolic build nucleocapsid containing the viral genome interacts with transmembrane viral surface proteins to get enveloped into the ER lumen and secreted out of an infected liver cell. Therefore a direct interaction between the capsid and surface proteins are predicted. The crystal structure of recombinant HBV capsids has recently been published. To mapped sites on the capsid surface important for envelopment by viral surface proteins 52 single amino acids were mutated to alanine residues. The phenotype of the mutations with respect to virion formation was tested by transcomplementation of a core-negative HBV genome in transiently transfected liver cells, immunoprecipitation of capsids and virions and radioactive labeling of the viral genome by the endogenous polymerase reactions (epr). 13 point mutations impeded nucleocapsid detection by epr, 28 were wild type (wt) and 11 mutations allowed nucleocapsid formation but blocked their envelopment and virion formation to undetectable levels. These mutations cluster in two small areas on the capsid surface. These areas are proposed to interact with envelope proteins during virion morphogenesis.Cell lines susceptible to HBV infection are still not available and functional HBV receptors has not yet been identified. However, transfection of the viral genome in human liver cell lines allows the formation of infectious virus indicating that the early steps in the viral life cycle are blocked. It is hypothesized that the block might be due to the lack of a viral receptor and might be overcome by expression of an artificial receptor for binding and uptake of virions. To generate such an receptor the cDNA for the heavy and light chains of the monoclonal anti-preS1 antibody MA18/7 binding to the large HBV envelope protein was cloned from mouse hybridoma cells via RT-PCR. The 3`-end of the heavy chain was fused to a transmembrane domain of IgD. It could be shown that both chains were stably expressed in hepatoma cells, that they were located at the cell membrane and directed to the outside of the cell. Incubation of MA18/7 transfected cells with HBV virions showed a specific binding of virions to the cells but no infection could be observed.
Keywords: hepatitis B; HBV; capsid envelopment; protein-protein interaction; core protein
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Während der Morphogenese des Hepatitits-B-Virus (HBV) wird das cytosolisch gebildete Nukleokapsid, welches u.a. das virale Genom enthält, durch Interaktion mit den transmembran lokalisierten viralen Hüllproteinen an zellulären Membranen umhüllt und erscheint anschließend als Virion im ER-Lumen, von wo aus es aus einer infizierten Leberzelle sekretiert wird. Hierfür wird ein direkter Kontakt des Kapsids mit den Hüllproteinen postuliert. Seit einiger Zeit ist die Kristallstruktur eines rekombinanten HBV-Kapsids bekannt. In dieser Arbeit wurden 52 einzelne Alaninsubstitutionen von Aminosäureseitenketten hergestellt, die auf der Oberfläche des Kapsids lokalisiert sind und mögliche Kontaktstellen für die Hüllproteine darstellen. Die Phenotypen der Mutationen hinsichtlich Virionbildung wurden anschließend durch Transkomplementation eines corenegativen HBV-Genoms nach transienter Transfektion in Leberzellen, Immunpräzipitation von Kapsiden und Virionen sowie radioaktiver Markierung des viralen Genoms durch die endogene Polymerase Reaktion (EPR) charakterisiert. 13 der Punktmutationen erschienen Negativ im Nachweis von Nukleokapsiden durch die EPR. 28 Mutationen zeigten einen Wildtyp-Phänotyp; hier wurden sowohl zelluläre Nukleokapside als auch sekretierte Virionen nachgewiesen. 11 Mutationen zeigten den gesuchten Phänotyp: Es konnten zwar zelluläre Nukleokapside jedoch keine sekretierten Virionen nachgewiesen werden. Die Positionen dieser Punktmutationen zeigten zwei Kluster auf der Oberfläche des Kapsids auf. Beide Bereiche dieser Kluster stellen potentielle Kontaktstellen zu den viralen Hüllproteinen dar.Es gibt derzeit noch keine Zelllinie, die sich mit Hepatitis-B-Viren infizieren lässt. Der hierfür notwendige HBV-Rezeptor ist bisher noch unbekannt. Jedoch führt die Transfektion von viralem Genom in Leberzellen zur Bildung von infektiösen Virionen, so dass anzunehmen ist, dass die frühen Prozesse des Infektionszyklus in kultivierten Leberzelllinien gestört sind. Es wird vermutet, dass durch Inkulturnahme von Leberzellen der virale Rezeptor verloren gegangen ist, was möglicherweise durch Expression eines künstlichen Rezeptors für Virusbindung und Aufnahme wiederhergestellt werden kann. Zur Herstellung eines solchen Rezeptors wurde die cDNA der schweren und leichten Kette eines monoklonalen PräS1-Antikörpers MA18/7 gegen die Hüllproteine mittels RT-PCR aus einer Maus-Hybridomzelllinie kloniert. Die schwere Kette wurde mit der Transmembrandomäne eines IgD fusioniert. Es konnte gezeigt werden, dass nach transienter Transfektion beide Ketten stabil in Leberzellen expremiert wurden, dass dieses künstliche Rezeptorkonstrukt in der Zellmembran lokalisiert war und nach außen zeigte. Die Inkubation MA18/7 transfizierter Zellen mit HBV-Virionen zeigte zwar eine Bindung an der Zelloberfläche, führte jedoch nicht zu einer Infektion.
Schlagwörter: Hepatitis-B; HBV; Umhüllung des Kapsids; Protein-Proteininteraktion; Coreprotein; 570 Biowissenschaften; Biologie