Arabidopsis thaliana class II TGA transcription factors provide a molecular link between salicylic acid and ethylene defense signalling
Arabidopsis thaliana Klasse II TGA-Transkriptionsfaktoren verbinden den Salicylsäure- mit dem Ethylen-Signalweg
by Mark Zander
Date of Examination:2011-04-27
Date of issue:2011-11-15
Advisor:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:Prof. Dr. Andrea Polle
Referee:Prof. Dr. Jan Schirawski
Referee:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:PD Dr. Thomas Teichmann
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Since plants are exposed to a multitude of different attackers, a complex innate immune system has evolved to protect them from devastating diseases. Depending on the type of pathogen or pest, at least one the three major stress signalling hormones which coordinate further defense responses is synthesized (Glazebrook, 2005): Salicylic acid (SA) requires the redox-regulated co-activator NPR1 and TGA bZIP transcription factors to induce defense genes, is required to combat biotrophic pathogens; jasmonic acid (JA) leads to the degradation of JAZ repressor proteins to release MYC transcription factors; ethylene (ET) leads to the stabilization of transcription factor EIN3. Both pathways merge at the promoter of transcription factor ORA59 which triggers defense responses against necrotrophic pathogens (Pre et al., 2008). In the absence of ET, JA-activated MYC2 coordinates the response against insects. The three defense pathways act mutually antagonistic indicating that their simultaneous activation is evolutionary disadvantageous. This thesis has identified subclass II TGA transcription factors and their interacting CC-type glutaredoxins as the key regulatory module that mediates the antagonistic action of SA and JA on the JA/ET-pathway. In Chapter II we demonstrate that the Arabidopsis thaliana subclass II TGA transcription factors, which had been previously described as essential activators of the SA pathway, are positive regulators the JA/ET pathway. Evidence for this was provided by the increased susceptibility of tga256 triple mutant plants against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea and decreased expression of the marker gene of the JA/ET response PDF1.2. In contrast, mutations in AtMYC2, the key positive regulator of the JA pathway, led to hyper-induction of the pathway. JA/ET-induced expression of PDF1.2 was restored in the tga256 myc2 quadruple mutant, indicating that TGA factors and MYC2 act as mutual suppressors on the JA/ET pathway. Interestingly, this tga256 myc2 mutant is insensitive to the antagonistic effect of SA establishing the concept that the positive function of TGA factors in the JA/ET-pathway serves to install the SA sensitivity. In Chapter III we show that the compromised defense gene expression in tga256 mutant plants after ET treatment is a direct consequence of the reduced expression of ORA59, the master integrator of the JA/ET pathway (Pre et al., 2008). Chromatin immunoprecipitation analyses demonstrated ET-induced direct binding of TGA factors to the TGACG motif at the ORA59 promoter. The functional importance of the TGA binding was further supported by analyses of transgenic ORA59Pro:GUS plants which indicated a crucial function of the TGACG motif for promoter activity. Moreover, SA-induced susceptibility of Arabidopsis plants towards infection with Botrytis cinerea was abolished in the tga256 mutant. Microarray analyses demonstrated that one third of all ET-induced genes is under positive transcriptional control of TGA factors. Interestingly, nearly all genes which are negatively affected by SA require TGA factors for being induced by ET. Collectively, these data support the idea that the positive function of TGA factors within the JA/ET pathway is targeted by SA to down-regulate the JA/ET-pathway. Chapter IV takes up the question how the antagonistic affect of SA on the TGA function is executed. A likely candidate is the previously described glutaredoxin GRX480 which combines multiple criteria of a cross-talk mediator: It interacts with TGA factors, its expression is SA-inducible and its over-expression suppresses JA/ET-induced defense gene expression (Ndamukong et al., 2007). This list was extended by our findings that the GRX480-mediated suppression is integrated at the ORA59 promoter. Loss-of-function evidence could not be provided, probably due to a functional redundancy within the glutaredoxin family. Seventeen plant-specific CC-type glutaredoxins were screened for their potential to suppress the ORA59 promoter using a transient expressions system that allowed monitoring the negative effect of glutaredoxins on the ORA59 promoter. Ten out of the 17 tested glutaredoxins revealed suppression capacity. Only these glutaredoxins contained the C-terminal ALWL motif which was previously described as crucial for glutaredoxins to mediate developmental processes in flowers (Li et al., 2009). In Chapter V, the interplay between MYC2 and GRX480 was explored since both factors negatively regulate the JA/ET-pathway in a TGA-dependent manner. JA-induced GRX480 expression was shown to be MYC2-dependent, giving rise to the hypothesis that MYC2 exerts its negative effect through GRX480. The down-regulation of the JA/ET-pathway as a result of the MYC2/GRX480 action removes the suppressive effect of the JA/ET-pathway on the JA-pathway. The hyper-stimulation of MYC2 expression which is observed in plants ectopically expressing GRX480, can therefore be regarded as a result of a MYC2-driven feed-forward loop. Collectively, the thesis has established a working model that envisions the ORA59 promoter as a target site for the antagonism of SA and JA on the JA/ET pathway. Mechanistically, this antagonism is established through TGA factors that enhance ORA59 promoter activity by synergistically interacting with EIN3 and a yet unknown JA-responsive transcription factor. TGA factors recruit JA- and SA-induced glutaredoxins that down-regulate ORA59 promoter activity by redox-modification of a yet unknown target protein.
Keywords: plant immunity; TGA factors; glutaredoxins; salicylic acid; jasmonic acid; ethylene; hormone crosstalk
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Pflanzen haben ein kompliziertes Immunsystem evolviert, um sich gegen Krankheitsausbrüche, die durch unterschiedlichste Pathogene hervorgerufen werden können, zu schützen. Je nach Pathogen-Typ werden bei der pflanzlichen Immunreaktion unterschiedliche Signal-Hormone synthetisiert, die die jeweils geeigneten Abwehrantworten initiieren (Glazebrook, 2005). Salicylsäure (SA) ist bei der Bekämpfung von biotrophen Pathogenen von entscheidender Bedeutung. Essentielle Komponenten des SA-Signalweges sind der redox-regulierte Co-Aktivator NPR1 und die TGA-Transkriptionsfaktoren. Zur Abwehr von nekrotrophen Pathogenen wird sowohl der Jasmonsäure (JA)- als auch der Ethylen (ET)-Signalweg benötigt, deren beider Signale auf dem Promotor des Transkriptionsfaktors ORA59 integriert werden. Der JA-Signalweg ist auch ferner an der Abwehr von Insekten beteiligt. Das Zusammenspiel dieser drei Abwehr-Signalwege ist meist antagonistischer Natur. Diese Arbeit hat die TGA-Transkriptionsfaktoren und deren Interaktionspartner, die CC-Typ Glutaredoxine, als entscheidendes regulatorisches Modul im antagonistischen Zusammenspiel des SA- und JA-Signalweges auf den JA/ET-Signalweg identifiziert. In Kapitel II werden die Klasse II TGA-Transkriptionsfaktoren, die bisher nur bekannt als Aktivatoren des SA-Signalweges waren, erstmals auch als essentielle Aktivatoren des JA/ET-Signalweges beschrieben. Es konnte eine erhöhte Suszeptibilität der tga256-Dreifach-Mutante gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea, einhergehend mit einer reduzierten Expression des JA/ET-Markergens PDF1.2, festgestellt werden. Im Gegensatz dazu führte die Mutation des Transkriptionsfaktors MYC2 zur Hyper-Aktivierung des JA/ET-Signalweges. Die Wiederherstellung der JA/ET-induzierten PDF1.2-Expression in der tga256 myc2-Vierfach-Mutante deutete darauf hin, dass TGA-Faktoren und MYC2 als gegenseitige Suppressoren im JA/ET-Signalweg agieren. Interessanterweise war die tga256 myc2-Mutante gegenüber des antagonistischen SA-Effekts insensitiv, was darauf schließen lässt, dass die TGA-Faktoren im JA/ET-Signalweg einerseits als Aktivatoren fungieren, andererseits aber auch zur Integration des SA-Signals dienen. In Kapitel III konnten wir zeigen, dass die eingeschränkte Abwehrgen-Expression nach ET-Behandlung in der tga256-Mutante eine direkte Konsequenz der reduzierten ORA59- Expression ist. Das ORA59-Gen ist die entscheidende Integrationsstelle des JA/ET-Signalweges (Pre et al., 2008). Chromatin-Immunopräzipitations-Analysen konnten eine ET-induzierte Bindung von TGA-Faktoren am TGACG-Motiv des ORA59 Promotors zeigen. Analysen von transgenen ORA59Pro:GUS-Pflanzen konnten die Wichtigkeit dieser TGA-Binding am ORA59 Promotor für dessen Induzierbarkeit belegen. Des Weiteren konnte in der tga256-Mutante die SA-vermittelte Suszeptibilität gegenüber Botrytis cinerea nicht mehr beobachtet werden. Microarray-Analysen zeigten, dass ein Drittel der ET-induzierten Gene unter positiver Kontrolle der TGA-Faktoren steht. Interessanterweise ist die Induktion von Genen, die negativ durch SA beeinflusst werden, fast ausschließlich von TGA-Faktoren abhängig. Zusammengefasst stützen diese Daten die Idee, dass die positive Funktion der TGA-Faktoren im ET-Signalweg vom SA-Signalweg genutzt wird, um den JA/ET-Signalweg negativ zu regulieren. Kapitel IV befasst sich mit der Frage wie SA die Funktion der TGA-Faktoren beeinflusst. Ein möglicher Kandidat war das bereits beschriebene Glutaredoxin GRX480. GRX480 interagiert mit TGA-Faktoren, seine Expression ist SA-induzierbar und seine Überexpression supprimiert die JA/ET-induzierte Abwehrgen-Expression (Ndamukong et al., 2007). Wir konnten zeigen, dass die GRX480-vermittelte Suppression am ORA59-Promotor integriert wird. Loss-of-function -Beweise sind aufgrund des hohen Maßes an funktioneller Redundanz innerhalb der Glutaredoxin-Familie nicht erbracht worden. Das Suppressions-Potenzial von 17 pflanzenspezifischen CC-Typ Glutaredoxinen wurde daraufhin in einem transienten System getestet. 10 von 17 Glutaredoxinen konnten die ORA59-Promotor-Aktivität supprimieren und nur diese Glutaredoxine wiesen ein C-terminales ALWL-Motiv, welches bereits als essentiell für die Funktion von Glutaredoxinen in der Blütenentwicklung beschrieben wurde (Li et al., 2009). Im fünften Kapitel wurde der Zusammenhang zwischen MYC2 und GRX480 näher beleuchtet. Beide Proteine entfalten eine negative Wirkung auf den JA/ET-Signalweg, die jeweils abhängig von TGA-Faktoren ist. Die JA-induzierte GRX480-Expression erwies sich als MYC2-abhängig, was die Annahme nährte, dass MYC2 seine negative Wirkung durch das GRX480 ausübt. Die Suppression des JA/ET-Signalweges durch MYC2 und GRX480 führte wiederum zur Aufhebung des suppressiven Effekts des JA/ET-Signalweges auf den JA-Signalweg. Die Hyper-Stimulation der MYC2-Expression in Pflanzen, die ektopisch GRX480 exprimieren, kann daher als ein MYC2-getriebener feed-forward loop bezeichnet werden. Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass diese Dissertation ein Arbeitsmodell entworfen hat, bei dem die TGA-Faktoren am ORA59-Promotor die zentrale Integrationsstelle für die antagonistischen SA- und JA-Signale in den JA/ET Signalweg darstellen. Zum einen beeinflussen die TGA-Faktoren im synergistischen Zusammenspiel mit EIN3 und einem noch nicht bekannten JA-abhängigen Transkriptionsfaktor die ORA59-Promotor-Aktivität positiv. Zum anderen rekrutieren sie SA- und JA-induzierte Glutaredoxine, um den ORA59-Promotor durch Redox-Modifikation eines noch nicht bekannten Faktors negativ zu regulieren.
Schlagwörter: Pflanzen-Immunität; TGA-Faktoren; Glutaredoxine; Salicylsäure; Jasmonsäure; Ethylen; Hormon-Crosstalk