Biochemistry and physiological role of otoferlin

Abstract

Beim Menschen kann Taubheit durch Umwelteinflüsse, aber auch durch genetische Faktoren verursacht werden. Mutationen im Gen für otoferlin, die zu DFNB9, einer autosomal-rezessive nicht-syndromalen Schwerhörigkeit führen, sind eine genetische Ursache der Taubheit. Die Funktion von otoferlin ist noch nicht vollständig verstanden. Es wird vermutet, es könne sich um den Ca2+-Sensor für die synaptische Vesikel Fusion an den inneren Haarzellen Band Synapse, und als Regulator für den Vesikel Nachschub handeln. Wir analysierten die C-terminale C2 Domäne C2F im Detail durch CD-Spektroskopie, Fluorimetrie und mit einem Flotations-Assay. Wir fanden keine überzeugende Beweise für Ca2+ und Phospholipid bindung. Wir testeten auch die Ausirkung der pachanga Mutation, eine Mutation, die eine Reduzierung der Geschwindigkeit des Vesikel Nachschubs verursacht. C2FPga zeigt jedoch keine Unterschiede in den biochemischen Assays zu C2Fwt. Durch die Analyse des Protein-und mRNA-Spiegel haben wir jedoch festgestellt, dass bei OtofPga/Pga Tieren der otoferlin Protein-Spiegel im Vergleich zu Wildtyp-Tieren reduziert ist, wobei ein erhöhter mRNA-Spiegel vorliegt. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Zellen den Mangel an Protein zu kompensieren versuchen.Um die Hypothese, dass otoferlin ein Synaptotagmin 1 (Syt1) ähnlicher Ca2+-Sensor ist, haben wir versucht, otoferlin mit Syt1, dem Haupt-Ca2+-sensor an konventionellen Synapsen, zu ersetzen. Wir haben den viralen Gentransfer in innere Haarzellen (IHZ) durch transuterine Injektion in den embryonalen otocysten etabliert und mit dieser Methode Syt1 in IHZ von gehörlosen OTOF-/ - Mäusen exprimiert. Allerdings konnten wir die Hörfunktion nicht wieder herstellen. Als Kontroll-Versuch, aber auch als potenziellen gentherapeutischen Ansatz haben wir auch otoferlin in OTOF-/ - Mäusen mit der gleichen Technik exprimiert und wieder waren wir nicht in der Lage das Hören wiederherzustellen. Dennoch kann dies eine Strategie eröffnen, um Mutationen in otoferlin in vitro zu testen.Zusätzlich etablierten wir den pHluorin-basierten optischen Test der Exozytose in IHZ. Wir exprimierten pHluorin gekoppelt an den vesikulären Glutamat-Transporter 1 (VGLUT1). PHluorin ist eine pH-Wert abhängige GFP-Variante, die bereits in Neuronen verwendet wird. Seine Fluoreszenz erhöht sich bei der Vesikel Fusion mit der Plasmamembran und wird gequencht beim Ansäuern des vesikulären Lumens nach Endozytose, Wodurch Exozytose und Endozytose visualisiert wird. Wir fanden, dass das Konstrukt stark exprimiert wird, aber nicht ganz mit dem endogenen vGluT3 co-lokalisiert. Vorläufige Daten von A. Wong zeigen, dass die Fluoreszenz an Stellen mit Exozytose steigt, was darauf hin deutet, dass die Methode tatsächlich als optischer Test für Exo-und Endozytose in IHZ eingesetzt werden kann.